大鼠股直肌去负荷萎缩及再负荷恢复过程中的蛋白表达差异

周越 任媛媛 王瑞元

北京体育大学（北京 100084）

骨骼肌去负荷会产生废用性萎缩，出现明显的质量丢失和收缩能力下降等变化，而在特定的再负荷后又可恢复到正常水平。运动减退［1］、航天失重［2］和对骨折、瘫痪、神经性病变等疾病进行固定治疗或因此导致的运动减少等，均会发生去负荷导致的废用性肌萎缩［3］。

骨骼肌萎缩的过程涉及众多细胞内分子，蛋白组分失衡可导致肌肉收缩功能发生变化［4，5］。但以往相关研究大多集中于单个或少数几个基因和蛋白质，因此，整体分析并确定去负荷肌萎缩后究竟是哪些蛋白发生了变化及如何变化对了解骨骼肌收缩功能尤为重要。蛋白质组学（Proteomics）正是基于这种要求而诞生和发展的学科，采用蛋白质组学研究方法可有效地寻找和筛选2个样本之间的蛋白表达差异［6，7］。本研究采用双向电泳技术及大鼠尾部悬吊模型，从蛋白质组学角度研究骨骼肌去负荷肌萎缩过程中蛋白质的变化，筛选差异蛋白，探讨发生机制，为预防和治疗肌萎缩提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象及分组

Sprague-Dawley雌性大鼠24只，SPF级，8周龄，体重180～210克。购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2002-0001，动物编号：0668277]。标准饲料分笼饲养，自由饮食。室温22±2℃，相对湿度50%～70%，每日光照12小时。动物实验由北京实验动物福利伦理委员会北京体育大学分会批准。

大鼠适应性喂养1周后随机分为对照组（C）、去负荷2周组（U）与去负荷2周后自然恢复2周组（R），每组8只。对照组常规喂养，自由活动、饮食，共2周。

去负荷采用尾部悬吊模型：大鼠尾基部由透气胶布缠绕制成悬挂点，悬挂大鼠使其后肢悬垂脱离地面，身体长轴与水平面成25°～30°，前肢着地仍可自由旋转及自由进食饮水，共2周。

对照组和去负荷2周组于实验开始后第14天取材，去负荷2周后自然恢复2周组在实验后第28天取材。称重后采用戊巴比妥钠腹腔注射（45 mg/kg）麻醉大鼠。迅速剪取大鼠右腿股直肌称重，切割成小块后立即投入液氮内，肌肉组织-80℃保存。

1.2 蛋白质的抽提

采用TCA-丙酮沉淀法（pH4～7胶条）提蛋白。在液氮中将样品充分研磨成粉末，取100 mg转移至离心管中并加入2 ml蛋白提取液A（三氯乙酸0.2 g，巯基乙醇 1.4 µl，-20℃预冷丙酮 2 ml），-20℃沉淀过夜；4℃，40000 g离心1 h，弃上清，保留沉淀；用3倍体积的含0.07%（v/v）的巯基乙醇的冷丙酮将沉淀重悬，-20℃沉淀 > 1 h；4℃，40000 g离心1 h，弃上清，保留沉淀；将沉淀用真空干燥加速离心机抽干；将干燥粉末转移至10 ml离心管中，按30 µl/mg加入蛋白提取液B（7M尿素，2M硫脲，4%（w/v）CHAPS，40 mM DTT，ddH2O，使用前加入PMSF、LEUPEPTIN和 IPG Buffer pH4～ 7）；震荡摇匀后置于冰上1～2 h，期间每10分钟震荡1次；超声 10 s（2 s，59 s，20%）；4℃，30000 g离心 1 h，弃沉淀，保留上清。

为建立稳定的二维电泳图谱，每组标本重复进行二维电泳分离3次。温度控制在20℃，实验所需水均为去离子水。

1.3 双向电泳

采用Bradford法测定总蛋白含量。

等电聚焦：采用PROTEAN IEF Cell（BIO-RAD，USA）等电聚焦仪。pH 4～7线性规格IPGs胶条（Bio-Rad）。提取好的上清液按照测得的蛋白浓度与水化液（8M Urea，2%CHAP，0.002%溴酚蓝，DTT，IPG buffer）混合，蛋白含量为1500 µg，最终体积为400 µl。IPG胶条水化，泡胀20 min后，覆盖适量矿物油封闭。低电场（60V）下水化12 h后进行等电聚焦。等电聚焦程序设置：50V 12 h，150V 1h，300V 1h，600V 1h，1200V 1 h，10000V 2h聚焦到65000V·h。

平衡与转移：等电聚焦完毕后，取出胶条，先于平衡液I中平衡15 min，随后在平衡液Ⅱ中平衡15 min。平衡储液为0.05 M Tris-HCl（pH 8.8），6M尿素，30%甘油，2%SDS，0.002%BromopHenol blue，分装，-20℃保存。储液使用前加入2%DTT为平衡液I；加入2.5% Iodoacetamine 为平衡液II。后将胶条放于12%聚丙烯酰胺凝胶上，并覆盖2 ml的75℃琼脂溶液。

SDS-PAGE：第二向电泳在EttanTM DALT six Electrophoresis unit（GE Healthcare，Swede）垂直电泳槽上完成。起始电流为5 mA/gel，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流到20 mA/gel，当溴酚蓝指示剂迁移到胶的底部边缘时，结束电泳。使用低分子量Marker。

染色：用Coomassie G-250染液染色过夜，脱色3小时（20%甲醇，10%冰乙酸）。

1.4 图像扫描与分析

染色后的凝胶用方正Z-320扫描仪进行扫描，采用PDQuest软件（Bio-Rad）分析获得数字化图像，包括蛋白点的检测、背景扣除和点的匹配，以及等电点和分子量的校准等。选取表达量比值大于2倍或小于0.5的点作为差异蛋白质点。

分别对3组股直肌组织蛋白重复进行3次2-DE分离，选取正常对照组股直肌图谱为Master，将去负荷组和自然恢复组图谱与之比较，发现3组胶条重复性较好，匹配率分别为89%和92%。

1.5 统计学分析

数据均用平均数±标准差表示，组间采用SPSS软件进行独立样本t检验，显著性水平为P <0.05。

2 结果

2.1 大鼠体重与股直肌湿重

表1显示，与对照组相比，去负荷组大鼠体重显著下降（P < 0.01），股直肌湿重下降了21%（P< 0.01），股直肌湿重/体重也显著下降（P < 0.01）；自然恢复组上述三指标显著高于去负荷组（P <0.01），而与对照组相比无显著性差异。

表1 三组大鼠股直肌湿重与体重比较

2.2 双向电泳图谱中的差异蛋白质点（图1、表2）

（2）代谢蛋白：有8种与糖酵解和线粒体代谢相关的蛋白出现表达差异。去负荷2周组磷酸丙糖异构酶1表达下调，为对照组的0.31，自然恢复2周组恢复到对照组水平。去负荷2周组大鼠股直肌，-烯醇酶表达均明显上调，自然恢复2周组-烯醇酶异构体SSP6207恢复至对照组水平，而SSP7207持续上调；自然恢复2周组-烯醇酶异构体SSP6321和7303下调，仅SSP7303恢复到对照组水平，SSP6318和7303未恢复。去负荷2周组股直肌ATP合成酶链即线粒体前体、碳酸酐酶Ⅲ与过氧化物酶6表达上调，分别是对照组的2.81、2.18和2.51倍，恢复2周组持续上调未降低。去负荷2周组肌肉肌酸激酶M链表达上调，为对照组的10.41倍，自然恢复2周组表达下调，为去负荷2周组的0.11。去负荷2周组甘油三磷酸脱氢酶表达上调，恢复2周组亦持续上调未恢复（见表2，图 1）。

（3）应激蛋白：去负荷组有4种应激蛋白出现表达差异。去负荷2周组P20与热休克蛋白-6表达上调，自然恢复2周组仍持续上调，未见复原。去负荷2周组Hsp27表达与对照组未见差异，但自然恢复2周组与对照组相比表达上调。去负荷2周组股直肌B-晶体蛋白表达上调，是对照组的4.72倍，自然恢复2周组表达下调，为去负荷2周组的0.33（见表 2，图1）。

（4）其他蛋白：去负荷2周组运输蛋白血清白蛋白的两种异构体（SSP6422和7415）表达与对照组相比下调，自然恢复2周组上调恢复到对照组水平。去负荷2周组DJ-1 protein表达上调，自然恢复2周组持续上调（见表2，图1）。

表2 三组大鼠股直肌比较表达明显变化的蛋白质

3 讨论

3.1 肌萎缩模型

判定废用状态下肌肉萎缩程度的常用指标为肌肉湿重及湿重体重比。本实验中，去负荷2周后股直肌湿重下降21%及湿重体重比显著下降，表明悬吊2周后股直肌即出现明显萎缩，肌萎缩模型成功建立。Kauhanen［8］等使兔后肢于收缩位制动3天后，股中间肌纤维直径缩小15%；制动2周后，缩小50%；制动4周后，出现严重的肌原纤维纤维样变性，同时肌肉中的结缔组织明显增多。Seo［9］研究发现大鼠去负荷3周后比目鱼肌湿重下降了59%。总之，去负荷后骨骼肌明显萎缩，但因方式不同或所研究的骨骼肌部位不同，其肌肉萎缩和重量下降幅度有差异。自然恢复2周组体重、股直肌湿重及湿重体重比与去负荷组比较有显著性差异，而与正常对照组无显著性差异，表明自然恢复2周后大鼠肌萎缩基本缓解。

3.2 收缩蛋白

肌肉收缩主要由粗细肌丝相互作用产生，收缩蛋白轻链和重链表达的变化会引起肌肉质量和收缩力量变化，也会导致肌纤维类型转变。

肌球蛋白重链分子量大于220 kDa，采用双向电泳不能很好地观察其变化量。肌球蛋白轻链（MLC）是肌小节粗肌丝的组成成分。原肌球蛋白主要有加强和稳定肌动蛋白丝，抑制肌动蛋白与肌球蛋白结合的作用。MLC1与原肌球蛋白，在快肌中含量较高［10］。本研究中，去负荷2周后MLC1与原肌球蛋白，下降可能与去负荷后总蛋白量下降有关。MLC1表达下调可使横桥形成时肌球蛋白重链活性及稳定性下降，引起肌张力减弱。自然恢复2周后，仅原肌球蛋白恢复，可能与恢复时间有关。

MLC3主要存在于Ⅱ型纤维中，在Ⅱb纤维中的含量显著高于Ⅱa和Ⅱx纤维。Adams等［11］研究发现，在肌萎缩过程中快缩肌MHCⅡb增加，MHCⅡa与MHCⅡx蛋白减少。这可以解释本实验中去负荷2周后MLC3表达上调，恢复2周后MLC3恢复正常，即悬吊后快型肌纤维增加的结果。

MLC2在慢型肌纤维中含量较多，其下降可能与肌萎缩后慢型肌纤维向快型肌纤维转化有关。MLC2下调意味着蛋白合成和降解途径间的平衡向降解方向偏移。同时，这种在肌动蛋白－肌球蛋白系统中结构、组分的变化导致肌肉收缩功能降低［12］。

3.3 代谢蛋白

本实验结果表明，去负荷2周后，与糖酵解相关的烯醇酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶含量上调。这主要是去负荷导致肌萎缩后，肌肉不能正常收缩，出现缺血缺氧，从而有氧代谢减少、糖酵解增加，能量合成减少；同时，肌萎缩伴有肌纤维直径减小和纤维类型由慢向快转变，导致肌组织中糖酵解相关酶量增加。自然恢复2周后与糖酵解有关的酶含量虽有一定幅度下调，但未恢复到对照组水平，这可能与恢复时间和方式有关。

碳酸酐酶Ⅲ在哺乳动物骨骼肌中表达很高，主要集中在高耗氧型的慢收缩纤维即I型纤维中，在以糖酵解为主的快收缩纤维即II型纤维中含量极少［14］。本实验观察到的碳酸酐酶Ⅲ表达升高似与这种肌萎缩后肌纤维由慢向快的转型不一致，其原因有待研究。碳酸酐酶Ⅲ还有助于将机体产生的HCO3-转化成易于通过细胞膜的CO2［15］，有助于代谢产物从细胞膜排出；碳酸酐酶Ⅲ对维持细胞内pH值的稳定也起着重要作用［16，17］。碳酸酐酶Ⅲ升高是否与这种增加CO2排出、稳定内环境的要求提高，清除糖酵解产生乳酸能力的增加有关，同样值得深入研究。

肌酸激酶在骨骼肌能量转移中起重要作用，可逆地催化磷酸盐在ATP和肌酸之间的转化。研究发现［18］在去负荷肌肉中，肌肉特异性肌酸激酶与甘油三磷酸脱氢酶表达上调，于去负荷4天后达最高峰，28天后保持稳定，可认为是肌肉废用的标志。本研究与此结果一致，去负荷2周后肌酸激酶含量明显上调，再负荷2周后恢复正常。肌酸肌酶上调与肌萎缩过程中纤维类型由慢转快的表现一致。

Lawler等［19］在大鼠后肢去负荷导致废用性肌肉萎缩的模型中发现，肌肉氧化水平升高和抗氧化能力降低。本实验中去负荷2周后ATP合成酶链与过氧化物酶6上调可能是对肌萎缩过程中氧化应激的适应性反应。

磷酸丙糖异构酶（TPI）能催化磷酸二羟丙酮转变为甘油醛三磷酸，其表达下调使肌细胞内磷酸二羟丙酮明显增多，果糖1，6-二磷酸轻度增多，ATP合成率降低。本实验中，去负荷2周后磷酸丙糖异构酶表达下调与ATP合成减少有关，自然恢复2周后其表达上调。

3.4 应激蛋白

肌萎缩过程中应激蛋白表达上调与氧化应激有关。Powers等［20］认为氧化应激是蛋白降解通路的关键调节因素，它导致蛋白水解增加和肌肉萎缩。HSPs在维持细胞稳态、保护氧化应激反应、辅助蛋白合成以及修复错误折叠蛋白等方面具有重要功能。热休克蛋白HspB6、p20分别沉积在肌丝Z线、Ⅰ带和闰盘等处，通过与肌动蛋白和中间肌丝相互作用来稳定肌小节，维护肌原纤维和细胞骨架结构，其表达与肌肉收缩尤其是慢肌的收缩有关［21］；Hsp27主要功能是稳定微丝和细胞因子信号转导，其在非应激条件下位于细胞质，应激时移位于细胞核内，在正常细胞中表达水平相对较低，但应激条件可诱导10～20倍表达。本实验中，去负荷2周后 p20、Hsp27和HspB6表达略微上调，自然恢复2周后仍持续上调。这与Isfort［6，7］报道的后肢悬吊和去神经的比目鱼肌相应热休克蛋白表达下调相反，但与Andrianjafiniony等的研究结果［22］类似，即大鼠解悬吊14天时，肌肉重塑过程中氧化应激仍处于较高的激活状态。这可能与观察的肌组织部位或取样时间不同有关。

3.5 其他蛋白

血清白蛋白对维持血液渗透压有重要作用，有研究［25］发现，它能充当亚铁血红素并清除自由基，促进脂质代谢。临床采用缺血时血清白蛋白末端序列发生改变所形成的缺血修饰白蛋白（ischemia modified albumin，IMA）作为心肌缺血的早期诊断和预后评估。有学者［26］观察到静坐工作者IMA水平比参加有氧运动者略低。本研究中，去负荷2周后血清白蛋白表达下调，自然恢复2周后表达上调，是否与其有相似的机制仍需研究。

4 总结

本研究采用蛋白组学技术整体分析了去负荷和再负荷恢复后骨骼肌蛋白表达的变化，表达差异较大的主要是收缩蛋白、代谢蛋白和应激蛋白，其表达变化可能是导致骨骼肌去负荷萎缩的原因。本研究尚未发现类似转录因子及信号转导类蛋白的表达出现明显变化，这可能与其在肌组织中的丰度较小有关，尚需进一步研究。

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