3种渗透调节物质对马铃薯试管苗生长和保存的影响

李 静

(河南农业大学园艺学院，河南郑州450002)

马铃薯(Solanum tuberosum L.是茄科、茄属)无性繁殖作物，是继玉米、小麦和水稻之后的世界第4大粮食作物.由于马铃薯非中国原产作物，中国现有的马铃薯资源均为国外引进和适应性选择保留品种，因此其遗传背景较为狭窄［1］，这在一定程度上限制了马铃薯育种工作的进展.近年来，国际间种质资源的交流日益频繁，马铃薯种质资源引进已成为国内马铃薯育种工作的重要内容之一，安全有效的种质资源保存方法为种质资源利用提供重要保障.组织培养是马铃薯快速繁殖和种质保存的基本方法，采用马铃薯试管苗茎段进行的离体培养和种质保存技术较为成熟.然而，在以蔗糖为唯一碳源的培养基中，马铃薯试管苗生长速度较快，需要定期进行继代繁殖，因而人工成本较高［2］.延缓马铃薯试管苗的生长速度可降低组培继代次数，进而节约人工成本.通过添加渗透调节物质增大培养基中渗透压，延缓马铃薯试管苗吸收营养物质的速度，以减低试管苗生长速度，是降低种质资源保存人工成本的有效途径［3，4］.本研究通过蔗糖、甘露醇和聚乙二醇(PEG6000)3种渗透调节物质对马铃薯试管苗生长的影响，以期为降低马铃薯种质资源保存的人工成本提供参考和依据.

1 材料与方法

1.1 材料

以马铃薯(Solanaum tubersum L.)品种“郑薯5号”的试管苗为材料，试管苗培养于附加30 g·L－1蔗糖的MS固体培养基中，选取生长比较一致的试管苗作起始材料，苗高(10±1)cm.试验所用的渗透调节物质分别为蔗糖、甘露醇和PEG6000，均购自广东汕头市西陇化工厂.

1.2 接种与培养

切去试管苗顶端和基部带芽节段，取中部单芽节段(长1 cm)，分别接种于添加不同质量浓度蔗糖、PEG6000或甘露醇的MS培养基中.1)蔗糖:MS基本培养基中分别添加质量浓度为0，30，60，90，120 g·L－1蔗糖;2)PEG6000:MS 基本培养基中分别添加质量浓度为 0，20，40，60，80 g·L－1PEG6000，并附加20 g·L－1蔗糖;3)甘露醇:MS 培养基中分别添加 0，5，10，20，40 g·L－1甘露醇，并附加20 g·L－1蔗糖.配制好的培养基分装于100 mL三角瓶中，每瓶35 mL，于灭菌锅(121℃，1.04 kg·cm－2)灭菌15 min.每处理包括4～6个三角瓶，每瓶接种9个单芽节段.接种后的茎段培育于(25±1)℃的培养室中，光照度50～60 μm·m－2·s－1，光周期16 h/8 h，培养过程中材料不进行继代，每处理重复3次.

1.3 生长指标的测定

接种的茎段培养90 d后统计各处理的存活率，并测量新生试管苗的株高、茎粗、节间长和单株鲜重.

1.4 遗传稳定性评价

采用CTAB小量法［5］抽提各处理的试管苗基因组DNA，利用已报道的RAPD引物［5］对试管苗基因组DNA进行PCR扩增.PCR反应在PTC－200型PCR仪上进行，反应体系为:1×buffer，50 ng模板 DNA，1.5 mmol·L－1MgCl2，200 μmol·L－1dNTPs，0.4 μmol·L－1引物，1 U Taq 酶.反应程序为:94℃预变性5 min;94℃ 1 min，36℃ 1 min，72℃ 2 min，循环40次;72℃延伸8 min.PCR产物在加有0.5 mg·L－1EB的0.8%琼脂糖凝胶中电泳分离，并在紫外透射仪上观察、照相，统计各保存试管苗的多态性条带数目.

2 结果与分析

2.1 蔗糖对马铃薯试管苗生长的影响

在组织培养中，蔗糖一方面为组织细胞的生长提供碳源，另一方面作为渗透调节物质维持细胞内外的渗透平衡.在不加蔗糖的MS培养基上，马铃薯试管苗呈徒长趋势，苗体纤细、瘦弱，且存活率随着培养时间延长而下降.在添加30～120 g·L－1蔗糖的培养基上，试管苗的存活率几乎达100%，但其生长情况随蔗糖不同而呈现一定的差异(表1).随着蔗糖的增加，试管苗株高、节间长、单株鲜重不断下降，而茎粗有所增加，说明高蔗糖对马铃薯试管苗生长有抑制作用.120 g·L－1蔗糖对试管苗生长抑制效果最明显，株高、节间长和单株中均为最低值，茎粗最大，但各项指标与90 g·L－1蔗糖的抑制效果差异不显著，说明90 g·L－1蔗糖即可达到抑制试管苗生长的效果.

表1 不同质量浓度蔗糖对马铃薯试管苗生长的影响Table 1 Effects of different concentrations of sucrose on growth of potato test-tube plantlets

2.2 PEG6000对马铃薯试管苗生长的影响

PEG6000是常用的渗透调节物质，它可引起水分胁迫，从而导致试管苗形态的改变.由表2可知，在培养基中添加PEG6000后，马铃薯试管苗生长受到了抑制，其抑制程度与PEG6000质量浓度有关，而不加PEG6000的培养基(对照)上植株生长正常.在添加20 g·L－1PEG6000的培养基上，马铃薯试管苗生长虽然受到了一定的抑制，但不如其它质量浓度明显.40 g·L－1明显的抑制了试管苗的生长，其试管苗成活率虽有所下降(96.6%)，但与0 g·L－1差异不显著，株高、茎粗、节间长和单株鲜重分别为 3.22 cm，0.65 mm，0.80 cm和40.44 mg，显著低于对照的相应指标.进一步增大培养基中 PEG6000的质量浓度(如 60，80 g·L－1)，尽管试管苗的株高、茎粗、节间长和单株鲜重均有所下降，但并不显著，而且试管苗的存活率显著降低，这可能导致所保存的种质资源丢失.因此，40 g·L－1PEG6000最适宜于马铃薯试管苗的保存.

表2 不同质量浓度PEG6000对马铃薯试管苗生长的影响Table 2 Effects of different concentrations of PEG6000 on growth of potato test-tube plantlets

2.3 甘露醇对马铃薯试管苗生长的影响

甘露醇是通过提高培养基中渗透压来抑制培养物芽的生长和主芽伸长.由表3可知，随着培养基中甘露醇质量浓度不断增大，马铃薯试管苗生长速度越来越缓慢，各项指标均低于对照.其中，20 g·L－1处理的试管苗成活率为95.2%，与对照差异不显著，株高、茎粗、节间长和单株鲜重显著低于对照，说明20 g·L－1甘露醇尽管显著抑制了试管苗生长，但对其成活率影响不大，适宜于马铃薯试管苗的保存.而40 g·L－1处理的试管苗的大部分形态指标进一步下降，生长速度有所减慢，且其成活率亦显著降低，不利于马铃薯试管苗的保存.

表3 不同甘露醇对马铃薯试管苗生长的影响Table 3 Effects of different concentrations of mannitol on growth of potato test-tube plantlets

2.4 保存试管苗的遗传稳定性评价

比较分析表1～3可知，尽管较高的蔗糖、聚乙二醇和甘露醇均能延缓马铃薯试管苗的生长，但三者的抑制效果不尽一致.抑制效果最好的是PEG6000 40 g·L－1，其次为甘露醇 20 g·L－1，抑制效果最差的是蔗糖90 g·L－1.试验中还发现，保存于40 g·L－1PEG6000的试管苗在培养90 d后生长量较小，培养基并未耗尽，未出现植株生长不良的现象.而保存于90 g·L－1蔗糖和20 g·L－1甘露醇的试管苗由于培养基几乎耗尽而生长较差.

图1 RAPD引物S66的扩增带谱Fig.1 Band pattern produced by RAPD primer S66

为了评价各处理的试管苗的遗传稳定性，分别随机选取19株保存于附加90 g·L－1蔗糖，40 g·L－1PEG和20 g·L－1甘露醇的培养基上试管苗，用于分析各单株的基因组变化情况.采用18个RAPD引物(S64～S345)对3种培养基上共57株试管苗基因组进行PCR扩增，通过预实验发现所有引物均能扩增出清晰的带谱，每条引物所扩增的带数为3～10条，18个引物共扩增出146条，片段大小为200～3 000 bp.编号为S66的引物在保存于附加40 g·L－1PEG6000培养基的试管苗中的扩增带谱见图1.结果发现，在所有单株中均未检测到多态性条带，说明在培养基中添加蔗糖、PEG6000和甘露醇不会导致马铃薯试管苗发生无性系变异，即3种保存方法均具有很好的安全性.

3 结论与讨论

目前，在马铃薯种质资源保存研究中，大多研究在培养基中添加生长抑制剂，如矮壮素(CCC)、比久(B9)、多效唑(PP333)、脱落酸(ABA)等［7，8］，以降低马铃薯试管苗生长速度，从而控制试管苗的生长速度，但这些生长抑制剂容易导致试管苗存活率降低，而致使种质丢失.赵建萍等［7］发现添加20 mg·L－1B9或CCC的培养基中马铃薯试管苗继代周期虽有所延长，但60 d时的存活率分别只有42%和68%.在培养基中添加一定的渗透调节物质，可降低试管苗吸收培养基中营养物质的速度，以避免生长抑制物质对试管苗的强烈抑制作用而导致试管苗死亡.本研究采用蔗糖、PEG6000和甘露醇作为渗透调节物质，均降低了马铃薯试管苗的生长速度，但对其存活率没有影响.这说明渗透调节物质适宜于马铃薯种质资源保存.

无性系变异是植物组织培养常见的现象，而对于种质资源保存研究而言，无性系变异无疑是有害的，因为它可能导致种质资源丧失优良特性［8］.组织培养中高的生长抑制剂则容易导致无形系变异的发生［10］.徐君［11］认为采用渗透调节物质可避免高生长调节剂所引起的无性系变异.本研究采用RAPD标记分析发现，保存于添加蔗糖、PEG6000和甘露醇的培养基上的马铃薯试管苗，未扩增出多态性片段，即没有发生无性系变异，说明这3种渗透调节物质可安全的用于马铃薯种质保存.

［1］ 邸 宏，陈伊里，金黎平.RAPD和AFLP标记分析中国马铃薯主要品种的遗传多样性［J］.作物学报，2006，32(6):899－904.

［2］ 林长春，李其文.马铃薯茎尖培养脱毒与种质资源试管保存的研究［J］.马铃薯杂志，1989，3(2):73－78.

［3］ 周明德.马铃薯种质试管苗保存［J］.作物品种资源，1989(3):42－43.

［4］ 贺 冰，赵月平，邹秀丽，等，微生物菌剂与化学肥料配施对番茄菌生长的影响［J］河南农业大学学报，2010，44(5):528 －532

［5］ WANG H，QI M，CUTLER A J.A simple method of preparing plant samples for PCR［J］.Nucleic Acids Research，1993，21:4153－4154.

［6］ 邸 宏，陈伊里，卢翠华.中国马铃薯部分品种资源遗传多样性的RAPD分析［J］.东北农业大学学报，2008，39(7):1－4.

［7］ 艾 辛，夏志兰，刘明月，等.植物生长调节剂对马铃薯试管苗生长和保存的影响［J］.湖南农业大学学报:自然科学版，2005，31(5):514 －517.

［8］ 赵建萍，蒋小满，柏新富，等.PP333，B9和CCC对脱毒马铃薯试管苗繁殖的影响［J］.植物生理学通讯，2003，39(6):571 －574.

［9］ ENGELMANN F.In vitro conservation of tropical plant germplasm-a review［J］.Euphytica，1991，57:227－243.

［10］刘进平，郑成木，胡新文.体细胞无性系变异研究进展［J］.华南热带农业大学学报，2010，7(2):22－29.

［11］徐 君.马铃薯种质资源慢生长保存研究［D］.武汉:华中农业大学，2007.