影响美洲大蠊药材中游离氨基酸测定的因素研究

王加党，李艳玲，贺永梅，孙晓梅，杨永寿

（大理学院药学与化学学院，云南大理 671000）

影响美洲大蠊药材中游离氨基酸测定的因素研究

王加党，李艳玲，贺永梅，孙晓梅，杨永寿*

（大理学院药学与化学学院，云南大理 671000）

目的：研究影响美洲大蠊药材中游离氨基酸含量测定的各因素，确定最佳检测条件。方法：采用单因素实验和正交设计实验，对溶剂浓度、物料比、提取时间、提取次数、活性炭用量、脱色时间、缓冲溶液的pH值、显色时间进行考察。结果：美洲大蠊药材中游离氨基酸的最佳提取条件为：8倍量65%乙醇，回流提取3次，每次60 min；最佳测定条件为：脱色时活性炭和样品的比例为4∶100，脱色时间10 min，显色时缓冲溶液的pH=6.0，水浴加热显色30 min。结论：该提取条件和测量方法适用于美洲大蠊中游离氨基酸的含量测定。

美洲大蠊；游离氨基酸；含量测定；影响因素

美洲大蠊（Periplaneta americana Linnaeus）为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫〔1〕，俗称“蟑螂”、“偷油郎”，是世界上最古老、生命力最强的昆虫之一。主要分布在热带和亚热带地区，喜欢阴暗潮湿、温暖的环境。因其对病菌的传播，故被列为世界性卫生害虫〔2〕。但近年来的研究表明，美洲大蠊具有较高的药用价值〔3-7〕。在我国，美洲大蠊作为药用昆虫最早载于《神农本草经》，美洲大蠊性寒，味咸，治血瘀症坚寒热、破积聚、喉咽闭、内寒无子等症〔8〕，具有破瘀化积、消肿、解毒、通利血脉之功效，常用于治疗小儿疮积、疔疮、喉蛾、无名肿毒等。我国科学工作者经过多年的研究，发现美洲大蠊体内含有活性很强的化学物质，并研发出“康复新液”、“肝龙胶囊”、“新脉隆注射液”等药物。美洲大蠊药材现行质量标准为云南省地方标准，其含量测定指标为游离氨基酸，但在长期的实验过程中发现，美洲大蠊中游离氨基酸测定方法中每一个影响因素的改变对实验结果的影响都非常大，为了保证测定结果的准确性，我们采用单因素试验对乙醇浓度、脱色时活性炭的用量、脱色时间、缓冲溶液的pH值、加热显色时间进行考察，采用正交试验对药材中游离氨基酸的提取时间、提取次数、料液比进行考察，以便进一步完善美洲大蠊的质量标准。

1 材料与仪器

1.1材料美洲大蠊药材购于大理州弥渡县养殖场，酪氨酸对照品购于中国药品生物制品鉴定所（批号：110821-200609），水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

1.2仪器TU-1901双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）、梅特勒电子天平AE240（梅特勒仪器有限公司）、DZKW-4电子恒温水浴锅（上海科析实验仪器厂）、超声波清洗器（上海科导超声仪器公司）、RE-3000旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、FYB5型万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限责任公司）、LD4-2型离心机（北京医用离心机厂）、pHS-25C型数字酸度计（梅特勒仪器有限公司）。

2 方法

2.1样品提取取粉碎后过50目筛的美洲大蠊干燥粉末10 g，精密称定，置250 mL烧瓶中，加一定浓度的乙醇按实验方案进行回流提取，过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏，浸膏加约40 mL沸水加热溶解，静置放冷、过滤，除去脂肪层，滤液于50 mL比色管中加蒸馏水定容，加活性炭0.4 g，振摇、静置、过滤，滤液即为供试品溶液。

2.2对照品溶液的配制（50.00μg/mL）精密称取80℃干燥至恒重的酪氨酸对照品5.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加0.02 mol/L的NaOH溶液10 mL于沸水浴中加热至完全溶解，冷却至室温，加蒸馏水至刻度，摇匀，即得。

2.3柠檬酸盐缓冲溶液的配置精密称取21.0 g柠檬酸于烧杯中，加200 mL蒸馏水使其充分溶解，滴加1 mol/L的NaOH溶液调pH至试验所需pH值，转移至500 mL量瓶中用蒸馏水定容，摇匀，即得。分别配置pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的柠檬酸盐缓冲液，备用。

2.4标准曲线的绘制精密吸取“2.2”项中制备好的酪氨酸溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，分别加入1 mL柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）和1 mL 1.0%的茚三酮乙醇溶液，摇匀，水浴加热30 min，取出，冷却至室温，分别加入60%乙醇3 mL，蒸馏水定容，摇匀，照中国药典附录中分光光度法于570 nm〔9〕处测定吸光度A。以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标绘制标准曲线，得回归方程：A=0.004 9C-0.241 2，r=0.999 9，结果表明酪氨酸含量在50~250μg范围之间呈良好的线性关系。

2.5供试品中总氨基酸的含量测定精密吸取供试品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，照“标准曲线制备”项下的方法自“分别加入1 mL柠檬酸缓冲液”起，依法测定吸光度，用标准曲线法计算出供试品溶液中总氨基酸的含量（μg），并照下列公式换算为美洲大蠊中总氨基酸的含量：

总氨基酸（mg/g）=（C×2.5×0.662）÷W

W为供试品重量（g）；C为氨基酸含量（μg）；2.5为溶液的稀释倍数；转换系数0.662是氨基酸的平均分子量120除以酪氨酸的分子量181.2所得。

3 单因素试验

3.1乙醇浓度的考察〔10〕取粉碎后过50目筛的美洲大蠊干燥粉末10 g，精密称定，置250 mL烧瓶中，按“表1”分别加入95%、85%、75%、65%、55%、45%的乙醇溶液回流提取1.5 h，按“2.1”项进行提取，按“2.5”项进行测定、计算，结果见表1。

表1 提取溶剂浓度考察结果

从表1结果可知，用65%的乙醇作提取溶剂效果最好，故实验中采用65%的乙醇作提取溶剂。

3.2脱色时活性炭用量选择〔11〕取粉碎后过50目筛的美洲大蠊干燥粉末10 g，精密称定，置250 mL烧瓶中，用65%的乙醇回流提取1.5 h后，除加入活性炭的量按“表2”要求外，其它操作按“2.1”项进行提取，按“2.5”项进行测定、计算，结果见表2。

表2 活性炭比例考察

从表2结果可知，药材与活性炭的比例为100∶4或100∶5实验结果都较好，故本实验采用100∶4的活性炭进行脱色。

3.3脱色时间的选择〔11〕取粉碎后过50目筛的美洲大蠊干燥粉末10 g，精密称定，置250 mL烧瓶中，用65%的乙醇回流提取1.5 h后，除脱色时间按“表3”要求进行外，其它操作按“2.1”项进行提取，按“2.5”项进行测定、计算，结果见表3。

表3 脱色时间的考察

从表3结果可知，加活性炭脱色，脱色时间大于10 min对试验结果无显著影响，为了使试验更方便，故本实验脱色时间选用10 min。

3.4缓冲溶液pH值的选择精密吸取“2.1”项中制备好的样品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按“2.5”项进行测定、计算，显色时缓冲溶液的pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。结果见表4。

表4 缓冲溶液pH值的考察

由表4结果可知，显色时溶液的pH值为6.0时测量结果最高，故确定缓冲溶液pH值为6.0。

3.5显色时间的选择〔12〕精密吸取“2.2”项中制备好的酪氨酸对照品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按“2.5”项进行测定、计算，显色时间和测定结果见表5。

表5 显色时间的考察

由表5结果可知，显色时间为30、40、50 min时测量结果都高，但30 min时测量结果较高一些，故确定显色时间为30 min。

4 正交试验

4.1提取条件的选择〔13-15〕为了优化提取工艺，根据美洲大蠊药材在提取过程中的影响因素，在单因素试验的基础上考虑提取时间、提取次数、物料比三个因素进行L9（33）正交试验，结果见表6。取粉碎后过50目筛的美洲大蠊干燥粉末10 g，精密称定，置250 mL烧瓶中，用65%的乙醇按照“表6”和“表7”正交试验方案进行回流提取，之后，按“2.5”项进行测定、计算。以总氨基酸含量为考察指标，结果见表7。

表6 因素水平

表7 L9（33）正交实验设计以及结果

正交试验结果的直观分析和方差分析表明：这三个因素对试验结果的影响次序为B>A>C，且三个因素对试验都有显著影响。从而可确定最优工艺为A3B3C1，即溶剂用量8倍，提取3次，每次3 h。但因考虑工厂实际生产以及该实验条件对测量结果的影响大小，故可确定最佳组合为A1B3C1，即最优工艺为：8倍量溶剂提取3次，每次1 h。结果见表8。

表8 方差分析表

4.2正交试验结果验证为验证由正交试验优选而得的最佳条件A1B3C1（即8倍量溶剂提取3次，每次1 h）组合的正确性，按此组合做3次平行实验，得该批美洲大蠊药材中游离氨基酸的含量为28.84 mg/g（RSD=1.03%），比任何一次试验的含量都高。这就进一步证明A1B3C1提取效果最好，为最佳组合。即最优提取工艺为：8倍量溶剂提取3次，每次1 h。

5 结论

本试验采用单因素实验和正交设计实验相结合，对影响美洲大蠊中游离氨基酸测定的各种因素进行研究，结果表明最佳提取条件为：8倍量65%乙醇，回流提取3次，每次60 min；最佳测定条件为：脱色时活性炭和样品的比例为4∶100，脱色时间为10 min；显色时缓冲溶液的pH为6.0，水浴加热显色30 min。

本试验正交结果显著性良好，该测定方法操作简便，考察全面，为美洲大蠊中游离氨基酸的准确测定提供理论依据，另外还可为美洲大蠊药材的进一步开发研究提供实验基础。

〔1〕蒙松年，肖小芹，罗臣，等.美洲大蠊中脂溶性成分的GC-MS研究〔J〕.中南药学，2008，6（1）：23-25.

〔2〕冯琳琳，张钟宪.美洲大蠊生物学特性及综合防治〔J〕.首都师范大学学报，2007，28（5）：37-39.

〔3〕胡艳芬，吕小满，王玉梅，等.美洲大蠊药用价值研究进展〔J〕.医学综述，2008，14（18）：2822-2824.

〔4〕廖剑英.康复新治疗恶性纤维组织细胞瘤1例〔J〕.大理学院学报，2003，2（3）：92.

〔5〕何正春，彭芳，宋丽艳，等.美洲大蠊化学成分及药理作用研究进展〔J〕.中国中药杂志，2007，32（21）：2326-2330.

〔6〕马家骅，蒋巧梅，徐华，等.美洲大蠊抗CCl4急性肝损伤作用的研究〔J〕.中药药理与临床，2008，24（3）：79-80.

〔7〕肖小芹，汪世平，徐绍锐，等.美洲大蠊提取物抗炎、镇痛作用的实验研究〔J〕.中国病原生物学杂志，2007，2（2）：140-143.

〔8〕孙星衍.神农本草经〔M〕.北京：商务印书馆，1955：90.

〔9〕国家药典委员会.中华人民共和国药典〔M〕.2005版二部.北京：化学工业出版社，2005，附录：22-23.

〔10〕李海波，蒋学云，杨永寿，等.美洲大蠊药材中总氨基酸提取工艺优化研究〔J〕.大理学院学报，2008，7（12）：3-5.

〔11〕杜青云，洪佳妮，陈锦珊，等.正交试验优选镰行棘豆总黄酮活性炭脱色工艺〔J〕.药学实践杂志，2011，29（2）：105-108.

〔12〕陈建琴.枇杷花中三萜类化合物的提取工艺研究〔J〕.莆田学院学报，2010，17（5）：25-27.

〔13〕杨静红，丁晓燕，周扬，等.紫外分光光度法测定银杏制品中黄酮的研究〔J〕.中国卫生检验杂志，2011，21（2）：337-338.

〔14〕李哲，李楠，赵铁华.正交试验优化金银花中绿原酸的提取工艺〔J〕.承德医学院学报，2011，28（1）：12-14.

〔15〕李叶，尹文清，冯华芬，等.瓜馥木总黄酮提取工艺研究〔J〕.粮油食品科技，2011，19（1）：56-58.

*通信作者：杨永寿，高级实验师.

（责任编辑 毛本勇）

Influence Factor Study of the Determination of Free Amino Acids in Periplaneta Americana Medicine

WANG Jiadang,LI Yanling,HE Yongmei,SUN Xiaomei,YANG Yongshou*
（School of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the influence factors of the determination of free amino acids in Periplaneta americana medicine and find out the best testing condition.Methods:Single factor experiment and orthogonal test design were applied to determine the solvent concentration,material ratio,extraction time,extraction times,active carbon dosage,decoloring time,pH value of the buffer solvent and coloring time.Results:The optimum extraction condition for free amino acids from the Periplaneta americana is that reflux extraction is applied to the 8 times of 65%ethanol for 3 times with each time lasting 60 minutes;the optimum testing condition lies when the ratio between active carbon and the sample is 4:100 in the 10 minutes'decolorization,and the pH value of the butter solvent is 6.0 in coloring and then water bath heating is applied for 30 minutes.Conclusion:The extraction and testing conditions are suitable for testing the amount of free amino acids in Periplaneta americana.

Periplaneta americana;free amino acids;content determination;influence factor

R284.2

A

1672-2345（2011）12-0012-04

国家自然科学基金项目（81060329）

2011-04-28

2011-08-30

王加党，药学专业本科生.