刍议银中杨的组织培养技术

2011-05-08宁军宁涛

中国新技术新产品 2011年1期

宁军宁涛

（开原市园林局，辽宁开原112300）

1.绪论。银中杨是以银白杨为母本，中东杨为父本的人工杂交而成，该树种生长迅速，材质结构细密，结实，抗旱，耐寒（抗低温-39?C），是优良造林树种，其树干通直，树皮光滑，灰绿色，叶被面呈银白色，树形美观，风格独特，雄系，无性系不飞絮，是城乡绿化，美化，净化环境的优良树种。本试验的地点是辽宁省开原市石台苗圃，试验时间是2006年至2007年。

2、材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 植物材料

本试验的材料来源：银中杨二年生植株上的当年生幼嫩枝条。本试验采取的外植体有两种，即幼嫩茎段（包括茎尖）。

2.1.2 试验所用的试剂：MS配方中的大量元素、微量元素、铁盐、有机物。植物激素类物质：6-BA，NAA。消毒剂及表面灭菌剂：75%的酒精，0.1%的升汞溶液。

2.2 试验方法

2.2.1 外植体的采取及处理

6月上旬开始在苗圃地选择生长健壮、无病虫害的二年生植株作为外植体来源，选择晴天上午剪取当年生幼嫩枝条，带回实验室后用自来水冲洗，去掉表面泥沙污物，放入烧杯中，加入适量洗涤剂搅匀，浸泡6-7min后倒掉洗涤剂溶液，在流水下冲洗30min左右，以清洗掉材料表面的油脂性污物。

2.2.2 外植体的表面灭菌

将冲洗过的材料移入超净工作台上进行表面灭菌，表面灭菌剂用0.1%的升汞溶液，为了提高灭菌效果，在表面灭菌前将材料用70%的酒精进行漂洗，具体方法是：取灭过菌的玻璃烧杯，倒入70%的酒精，将材料浸入酒精中，轻轻晃动4-5min后倒出酒精，表面灭菌为了增加灭菌效果，在表面灭菌剂升汞中加入2-3滴吐温-80，充分搅匀，用无菌水冲清洗材料6-8次，每次清洗时让材料在无菌水中浸泡1-2min，尽量减少升汞在植物组织中的残留。清洗后的材料用滤纸吸取表面多余的水分，以备接种。

2.2.3 培养基

银中杨组织培养的培养基中细胞分裂素的种类是6-BA，生长素的种类是NAA，二者的不同浓度和比例可以诱导不同的外植体脱分化。幼茎诱导培养基：MS+6-BA1.0+NAA0.05（单位：mg/L，以下同）。继代增殖培养基：MS+6-BA0.5+NAA0.05。生根诱导培养基：1/2MS+NAA-0.50 pH值为5.8

2.2.4 接种

2.2.4.1 幼茎接种

将表面灭菌后的材料放在滤纸上，用镊子剥去叶片，用手术刀将幼茎切成1-2cm长的茎段，每个茎段保持1-2个节，用镊子将茎段基部直插到培养基中，是茎段的顶端向上，保持形态学的极性。还要注意使茎段上的腋芽留在培养基上，每个培养瓶中接种一个茎段。接种后用耐压塑料薄膜封住瓶口，作好标记，注明接种材料、名称和接种日期。

2.2.5 培养条件

2.2.5.1 温度。组织培养过程所要求的温度为25±2℃。一般低于15℃时组织的生长停滞，高于30℃时对生长不利。银中杨的培养温度为25-27℃。

2.2.5.2 光照。银中杨组培过程中的每日连续光照为：9-10h/d，光照强度1000-2000Lx。

3、培养过程

3.1 茎段、茎尖培养

外植体接种到幼茎诱导培养基后20d左右，茎尖和茎段基部肿胀、膨大，顶芽和侧芽逐渐发育，继续培养至30-40后，形成2-3个芽的小芽丛。每4-5周为一个继代周期，及时转接到新的继代培养基上继续培养，经过2-3个周期的继代培养，小芽丛中的芽的数量逐渐增加，芽逐渐伸长，长到2-3cm，继代转接时将小芽丛切割分开，转接到新培养基中，两周后观察不同培养基上的丛生芽数量，芽的增殖倍数为4-9倍。茎尖和茎段接种后4-5个月可建立无性系。

3.2 生根培养

幼茎诱导的无根芽苗分切成单苗，接种到生根培养基中，一周左右即有不定根发生，2-3周有多条不定根发生，形成根系。为了促进不定根的分化，生根培养基中还可以加入2mg/L活性炭。

2.6.3 糖尿病患者对前列腺增生患者应重视是否有伴有糖尿病。入院时需询问患者有无糖尿病以及相关用药情况，并在病史中予以记录。术前应进行血糖、糖化血红蛋白、血尿酸、肝肾功能等评估。注意饮食调节、血糖监控，围手术期间积极维持原代谢疾病的药物治疗，必要时与相关科室联系进行相关药物的剂量调整。

3.3 试管苗的过渡移栽

3.3.1 过渡移栽的措施

移栽前将培养瓶移入温室或大棚内，打开瓶口炼苗1-2天。移栽时用镊子取出小苗，洗去培养基，植入移栽基质中，移栽基质为园田土：河沙：珍珠岩2：1：1，移栽后用细喷头喷透水。移栽后要保持空气湿度在80-90%，用塑料膜罩上，并适当遮光，一周内保持75%遮光度，一周后增加光照，保持50%遮光度，以后逐渐增加光照。温度保持在20-25℃。移栽初期保持基质湿润，但不积水。在移栽后的一周之内不施肥，一周后可以叶面喷施0.1%的磷酸二氢钾，每周2次，以促进根系发育，根系形成后可以随浇水根施氮、磷钾复合肥，每周1次，一个月后可定植到苗圃，进入正常管理。

4、问题与讨论

4.1 外植体表面灭菌方法

本试验采取以下三种不同的表面灭菌方法：第一种，0.1%升汞浸泡11min，无菌水冲洗6次。第二种，75%酒精浸泡1min，再用0.1%升汞浸泡11min，无菌水冲洗6次。第三种，75%酒精浸泡1min，再用0.1%升汞浸泡11min，升汞中加2-3滴吐温80，无菌水冲洗6次。上述三种表面灭菌方法的灭菌效果有明显差异，接种后2-3周的污染率和褐化率见表：

表4.1 三种灭菌方法污染率与褐化率

实验证明，银中杨外植体表面灭菌采用第二种方法较为合适，即先用75%酒精浸泡1min，再用0.1%升汞浸泡11min，无菌水冲洗6次。

4.2 继代培养基中细胞分裂素与生长素（6-BA与NAA）对芽增殖的影响。

细胞分裂素和生长素的种类、浓度对培养物的生长状况、增殖倍数起着重要的作用，适当降低激素浓度，特别是降低生长素的浓度，培养物的生长和芽苗的增殖都有明显的变化，使愈伤组织的生长受到抑制，质地均匀、颜色变绿，而且芽苗增殖提高。本试验以茎段培养物为材料，将细胞分裂素（6-BA）和生长素（NAA）做两因素三水平的正交实验设计，结果见表4.2。