乳腺癌细胞肿瘤标记物表达及其与临床病理特征相关性研究

王瑾 郑芹 杨惠玲

乳腺癌细胞肿瘤标记物表达及其与临床病理特征相关性研究

王瑾 郑芹 杨惠玲

目的探讨肿瘤标记物14-3-3σ、Akt和p27Kip1蛋白在乳腺癌中的表达及其与临床病理特征及Her-2的相关性。方法选取43份乳腺癌石蜡标本和10份正常乳腺组织标本，采用免疫组织化学技术( SABC )检测组织中14-3-3σ、Akt和p27Kip1蛋白的表达，结合临床资料和随访资料，进行回顾性研究，作出评估。统计学采用 Wilcoxon 秩和检验或 Kruskal-Wallis 检验，并采用 Kaplan Meier 法进行单因素生存分析。结果14-3-3σ、Akt可表达于细胞胞浆，而p27Kip1蛋白可表达于细胞胞浆或（和）胞核。胞浆14-3-3σ、Akt或p27Kip1蛋白胞浆表达均与淋巴结转移和临床分期呈正相关（P ＜ 0.01或P ＜ 0.05），并提示生存相对较差，p27Kip1蛋白胞浆错误定位的患者预后不良。Her-2蛋白可能对PI3k-Akt和p27Kip1通路参与乳腺癌致病起到一定作用。结论14-3-3σ、Akt或p27Kip1蛋白可作为判断乳腺癌淋巴转移和预后评估的有效指标。

乳腺癌；肿瘤标记物；14-3-3σ 蛋白；Akt 蛋白；p27Kip1蛋白

乳腺癌(breast cancer)是严重威胁妇女健康的一种恶性肿瘤。目前，乳腺癌发病率已跃居我国妇女癌症发病首位[1]。以癌基因( oncogene )或抑癌基因( tumor suppressor gene )作为肿瘤标记物已取得很大进展，它通过检测各种癌基因和突变的抑癌基因及其产物，为肿瘤的诊断和进一步治疗提供依据。14-3-3σ 蛋白是一种分子伴侣，Akt 蛋白是一种蛋白激酶，p27Kip1蛋白是细胞周期负调控因子。不同的研究表明它们的表达与肿瘤的发生发展存在密切关系，并且它们之间有相互调节和(或)制约作用。本研究应用免疫组化法对Akt、p27Kip1及 14-3-3σ 蛋白在乳腺癌组织中的表达情况进行检测，并对其与乳腺癌临床病理特征的关系及生存时间进行分析，以探讨其在乳腺癌的发生和发展中的作用。

资料与方法

一、一般资料

筛查中山大学肿瘤防治中心2002年全年乳腺癌患者的资料，从中选择了43例根治性手术切除的乳腺癌石蜡标本；另外选取10例癌旁正常乳腺组织石蜡切片作对照。病例选取的条件包括：患者术前均未行放、化疗，术后均有明确的病理学诊断；年龄27 ～ 73岁，中位年龄47.0岁。根据2002年国际抗癌联盟 （UICC）的TNM分期法：T1（肿瘤最大径≤2 cm）11例，T2（肿瘤最大径＞ 2 cm，但≤5 cm）17例，T3（肿瘤最大径＞ 5 cm）12 例，T4[任何大小肿瘤，直接扩散到胸壁和皮肤（胸壁包括肋骨、肋间肌和前锯肌，不包括胸肌）]3例；N0（无区域淋巴结转移）20例，N1-3（有同侧或对侧区域淋巴结转移）23例；所取标本均无远处转移。Ⅰ期6例，Ⅱ期 （Ⅱa+Ⅱb）26例，Ⅲ期 （ Ⅲa+Ⅲb+Ⅲc ）11例。

二、方法

Akt鼠抗人抗体购自 Cell Signaling 公司，p27Kip1兔多抗抗体及14-3-3σ山羊多抗抗体购Santa Cruz 公司，二抗及DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

标本经4﹪甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm切片，免疫组化 SABC 法检测实验步骤按说明书进行。抗原采用高温高压修复，用已知的阳性乳腺癌切片作阳性对照，用 PBS 取代一抗作阴性对照。

三、结果判读标准

14-3-3σ、Akt蛋白阳性着色为粗细不一的棕黄颗粒，主要定位于肿瘤细胞胞浆中；p27Kip1定位于肿瘤细胞核和（或）胞浆。染色按阳性细胞数占肿瘤细胞的比例进行分级[2-4]。Akt阳性细胞数 ＜ 10﹪为（-），10﹪ ～ 50﹪为（+），＞ 50﹪为（+ +）；P27Kip1阳性细胞数＜ 5﹪为（-），5﹪ ～ 50﹪为（+），＞ 50﹪为（+ +）；14-3-3σ 阳性细胞数 ＜ 10﹪为（-），10﹪ ～ 50﹪为（+），50﹪ ～ 75﹪为（+ +），＞ 75﹪为（+ + +）。

四、统计分析

应用SPSS 13.0软件包进行统计分析。计数资料分析组间相关采用秩和分析，同时进行Kaplan Meier 生存分析。以P ＜ 0.05为差异具有统计学意义

结 果

一、通过采用免疫组织化学方法检测发现与正常乳腺组织相比，在乳腺癌组织中 14-3-3σ、Akt 蛋白过表达，且定位于细胞浆（图1，2）；p27Kip1蛋白为细胞核和（或）细胞浆表达(图3，4）。

二、采用 Wilcoxon 秩和检验或 Kruskal-Wallis 检验(表1)，分析发现胞浆 14-3-3σ、Akt蛋白或 p27Kip1蛋白胞浆表达均与淋巴结转移和临床分期呈正相关；应用 Kaplan Meier 法进行单因素生存分析并所绘制5年生存曲线结果表明（图5，6）胞浆 14-3-3σ、Akt 蛋白过表达的病人生存期相对较短，p27Kip1蛋白胞浆错误定位的患者预后不良。

图1 14-3-3σ 蛋白在乳腺癌中表达（×200）

图2 Akt 蛋白在乳腺癌中表达（×200）

图3 p27Kip1蛋白在乳腺癌细胞浆中表达（×200）

图4 p27Kip1蛋白在乳腺癌细胞核中表达（×400）

表1 14-3-3σ、Akt 和 p27Kip1蛋白表达与乳腺癌临床病理特征相关性分析（例）

图5 14-3-3σ 蛋白表达水平与生存时间( Kaplan-Meier 生存曲线)

图6 Akt 蛋白表达水平与生存时间( Kaplan-Meier 生存曲线)

三、通过比较 14-3-3σ、Akt、p27Kip1蛋白与 Her-2的相关性发现，与 Her-2 阴性组比较，Her-2 阳性组的14-3-3σ、Akt 蛋白表达升高；而胞核 p27Kip1蛋白表达降低，胞浆表达水平升高；

四、Akt 与 ER 呈正相关，胞浆 p27Kip1蛋白表达与 PR 呈正相关，提示 PI3K/Akt 通路可能参与雌激素类蛋白表达，但具体机制仍有待进一步研究。同时，胞浆 Akt 和胞浆 p27Kip1表达水平与 VEGF 呈正相关，提示在 VEGF 促进血管内皮细胞增殖和抗凋亡的功能中，Akt蛋白和 p27Kip1蛋白可能发挥一定的作用。

讨 论

一、14-3-3σ 蛋白，又称人乳腺癌上皮标志物-1(human mammary epithelial marker 1, HEM1)[5]，是目前研究的所有14-3-3蛋白各亚型中与肿瘤关系最为密切的亚型[6]。Mong-Hong Lee等[7]在乳腺癌细胞株的研究发现 14-3-3σ 可以与 p53 结合稳定其表达，抑制其降解过程，提高其转录活性，使细胞周期阻滞在G2/M 期，从而抑制肿瘤增殖。

本研究是通过免疫组织化学方法检测 14-3-3σ 在乳腺癌组织中和正常乳腺组织中的表达情况，结果为14-3-3σ 蛋白在乳腺癌组织中表达是过量的。这一结果与多数研究中所报道的 14-3-3σ 蛋白在多种肿瘤中表达下降并不一致，其中有报道认为 14-3-3σ 蛋白在乳腺癌的表达增加[8]，而 Moreira 等[9]曾报道 14-3-3σ在乳腺癌表达下调只是偶发事件(表达缺失率3/68)。但多数报道支持由于 14-3-3σ 启动了 CpG 岛甲基化而导致在乳腺癌中该基因沉默[10]。但在此研究中14-3-3σ蛋白在Her-2阳性组织中表达增强,是否提示着14-3-3σ蛋白在Akt蛋白增加而p27Kip1蛋白降低情况下出现代偿性增高作用，14-3-3σ 蛋白的表达与肿瘤淋巴转移，TMN 分期有关，且随临床分期的增高，14-3-3σ 蛋白表达明显增高。这些均提示 14-3-3σ 蛋白在乳腺癌中的表达增多可能是一个预后不佳的潜在因素。生存曲线显示随 14-3-3σ 蛋白表达增强，生存率出现下降趋势。

二、Akt蛋白，又称为蛋白激酶B ( protein kinase B, PKB )，是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇-3-激酶( phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K )下游的直接靶蛋白，Akt 的活化依赖于 PI3K 对含有肌醇的膜磷脂酰肌醇环上3位羟基的特异磷酸化[11]。Akt 可通过多种途径或作用多种因子促进调亡。例如，Akt 可以作用于下游的凋亡蛋白 Bad，使其磷酸化，抑制其促凋亡作用[12]；Akt 磷酸化 Forkhead 蛋白家族，促进 Forkhead 蛋白离开细胞核，从而抑制促凋亡基因转录[13]；Akt 可催化 MDM2 的 Ser166 和 Ser188 磷酸化，而磷酸化的 MDM2更有效地转到核内，促使p53降解[14]，从而抑制凋亡。此外，Akt 参与多种途径调节细胞周期的进程，如 Akt 可磷酸化细胞周期抑制物P27Kip1使其失活，阻止 P27Kip1进入细胞核从而抑制P27Kip1介导的 G1 期阻滞，促进增殖[15]。

本研究显示乳腺癌中 Akt 蛋白在乳腺癌组织中高表达。此外，本研究对临床病理资料进行分析，Akt 与淋巴结转移和临床分期显著相关。这说明 Akt 可能与乳腺癌的发生发展有关，可用于临床乳腺癌病情和治疗的判断。对于生存分析，生存曲线显示了Akt 过表达的患者5年的生存率低于其表达阴性的患者。

三、p27Kip1蛋白，肿瘤的发生发展与细胞周期调控异常关系密切。细胞周期由正调控因子细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)和负调控因子CDK抑制因子(CDK inhibitor, CKI)共同作用而精切调控。p27Kip1为 CKI 两大家族之一的成员，p27Kip1定位于染色体12p13，主要通过对细胞周期从G1 期到S期的转换抑制来抑制细胞增殖，其主要通过抑制多种 Cyclin-CDKs复合物(如cyclinE/CDK2, cyclinD1/CDK4复合物)的活性来实现其对细胞周期的调控，它可抑制多种 Cyclin-CDKs 复合物的活性，对细胞周期进行负调控，抑制细胞分裂和增殖，促进细胞分化和凋亡[16]。

p27Kip1蛋白发挥活性的区域在细胞核，当 p27Kip1蛋白自身被磷酸化后，磷酸化的 p27Kip1从细胞核转入细胞浆，在细胞浆内通过泛素化-蛋白水解途径水解失活[17]。本研究检测 p27Kip1蛋白在乳腺癌组织的胞核表达率低于正常乳腺组织核表达。同时在胞浆表达丰富，高于正常乳腺组织胞浆表达。由此说明，p27Kip1可在胞浆和胞核表达，但对于肿瘤组织，由于磷酸化的 p27Kip1从胞核泄漏入胞浆，使得胞浆表达增加。实验表明，p27Kip1蛋白与淋巴结转移和临床分期有密切关系，与肿瘤大小无关。p27Kip1蛋白胞核表达降低及胞浆表达增加，可提示 p27Kip1蛋白从核泄入浆的量增多，造成 p27Kip1泛素化失活，从而失去抑制肿瘤的功能。p27Kip1蛋白的核浆定位颠倒可用于提示乳腺癌的发展程度。生存曲线显示了错误的核浆定位可能将不利于乳腺癌的预后。

四、乳腺癌的发生发展是一个多阶段和多步骤的复杂过程，其中涉及众多癌基因和抑癌基因失衡、信号通路传导异常和细胞周期调节的改变等。PI3k-Akt 和 p27Kip1通路参与乳腺癌的发生发展，并在细胞膜Her-2 蛋白参与下发挥作用（图7）。实验表明，在 Her-2 阴性(缺失状态)的乳腺癌组织中 Akt 蛋白的表达水平低于其在 Her-2 阳性组织中，提示 Her-2 存在情况下，Akt 蛋白表达增加，促进肿瘤细胞的增殖。同时 p27Kip1蛋白的胞核表达在 Her-2 阳性乳腺癌组织中也降低，而胞浆组织 p27Kip1蛋白表达水平升高，促进 p27Kip1蛋白从胞核到胞浆的释放和降解，失去抑制肿瘤的作用。以上提示，Her-2 蛋白存在或者缺失可能对 PI3k-Akt 和 p27Kip1通路有直接影响。14-3-3σ 蛋白在 Her-2 阳性组织中表达增强，其水平高于在 Her-2 阴性的乳腺癌组织中。根据以往的研究，14-3-3σ 作为一种抑癌基因可直接抑制Akt的表达，从而增强 p27Kip1蛋白的细胞周期负调控作用；也可以增加 p27Kip1蛋白的稳定性，阻止 p27Kip1蛋白出核发生降解[18]。但在此研究中 14-3-3σ 蛋白在 Her-2 阳性组织中表达增强，是否提示着 14-3-3σ 蛋白在Akt蛋白增加而 p27Kip1蛋白降低情况下出现代偿性增高作用、还是一种异常的反应、或者存在另外的蛋白分子影响其表达?这些需进一步探讨。

图7 Her-2 与 PI3K-Akt 通路在乳腺癌发病机制中作用

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Expression of three tumor markers in breast cancer tissue and its association with pathological characteristics

WANG Jin, ZHENG Qin, YANG Hui-ling. Department of Pathophysiology, Medical School, Sun Yat-sen University, GuangZhou 510080, China

YANG Hui-ling, E-mail: yanghl@mail.sysu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the expressions of 14-3-3σ, Akt and p27Kip1proteins in breast cancer, and evaluate their relations with clinicopathologic status and Her-2 protein.MethodsExpressions of 14-3-3σ, Akt and p27Kip1proteins were examined by immunohistochemistry (SABC) method and the retrospective analysis was conducted based on clinical data and follow-up.ResultsHigh-level expression of 14-3-3σ.Akt or p27Kip1protein in cytoplasm positively correlated with lymph nodal metastasis and TNM stage (P ＜ 0.01 or P ＜ 0.05), and probably predicted a poor prognosis; Her-2 protein may contribute to tumorigenesis and development of breast cancer mediated by PI3k-Akt and p27Kip1pathway.Conclusion14-3-3σ、Akt and p27Kip1proteins may serve as useful markers to predict lymph nodemetastasis and to evaluate prognosis of patients with breast cancer.

Breast cancer；Tumor marker；14-3-3σ protein；Akt protein；p27Kip1protein

2011-03-07)

(本文编辑:蔡晓珍)

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2011.01.011

510080 广州，中山大学病理生理学教研室

杨惠玲，E-mail：yanghl@mail.sysu.edu.cn

王瑾,郑芹,杨惠玲.乳腺癌细胞肿瘤标记物表达及其与临床病理特征相关性研究[J/CD]. 中华细胞与干细胞杂志: 电子版, 2011, 1(1): 74-80.