6-OHDA诱导过表达nurr1基因的SK-N-SH细胞凋亡

刘 扬 赵咏梅 张海燕 李卫红 岳 云*

(1.首都医科大学北京朝阳医院麻醉科，北京 100020;2.首都医科大学宣武医院中心实验室，教育部神经变性病重点实验室，北京 100053;3.首都医科大学细胞生物学教研室，北京 100069)

核相关受体因子(nuclear receptor related factor1，Nurr1)属于类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员，是未知配体的孤儿核受体，作为核转录因子，与神经前体细胞向多巴胺(dopamine，DA)能神经元方向分化、成熟密切相关［1］。在nurr1高表达的中脑黑质致密部，DA能神经元的退行性变性和丢失是帕金森病(Parkinson disease，PD)的主要病理特征［2］，但这种选择性损伤DA能神经元的病因和发病机制目前尚不清楚。动物实验［3］发现，敲除nurr1基因的小鼠只在黑质纹状体和腹侧被盖处不能形成DA能神经元，并伴随DA浓度明显下降，这与PD的病理特征极其相似;对PD患者的调查研究［4］证实了家族性PD患者的nurr1基因存在2个异体突变位点。由此推论，nurr1基因的功能可能与PD患者中脑DA能神经元损伤易感性相关，具体机制尚不明确。

PD患者的中脑黑质致密部DA能神经元病理变化可能存在一条共同的通路，即细胞凋亡。Hartmann A等［5］在PD死亡患者中发现中脑黑质DA能神经元的凋亡特征性改变，并检测到细胞缺失与凋亡起始因子Caspase-3的表达密切相关。细胞凋亡可能是引起PD患者黑质中DA能神经元死亡和丢失的直接原因。

本研究小组已经证明过表达外源性nurr1基因的SK-N-SH/Nurr1细胞对6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)损伤敏感性增强［6］。本实验通过观察6-OHDA作用于Nurr1+/－细胞株后，比较超微结构以及凋亡因子Caspase-3表达的变化，研究SK-NSH/Nurr1细胞损伤是否通过细胞凋亡途径，以明确Nurr1基因在SK-N-SH/Nurr1细胞对6-OHDA损伤易感性中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1)细胞株:人神经母细胞瘤株SK-N-SH细胞由首都医科大学细胞生物教研室提供，SK-N-SH/Nurr1细胞模型由本研究小组将表达nurr1基因的质粒载体pBK-RSV-Nurr1转染至SK-N-SH细胞后成功建立［7］。简言之，用脂质体基因转染法将带有nurr1基因的载体pBK-RSV-Nurr1转染至SK-N-SH细胞，经500 mg/L G418筛选。为排除质粒转染对细胞可能存在的影响，本研究还设立了过表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的 SK-N-SH/EGFP细胞平行对照组。

2)细胞培养试剂:DMEM(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。转染细胞鉴定试剂:Nurr1抗体(Santa Cruz公司);SP免疫组化试剂盒(Zymed Laboratories公司);TRIzol(Gibco公司);RT-PCR第一链合成试剂盒(Invitrogen公司);PCR PreMix反应体系(北京赛百盛基因技术有限公司)。药物实验试剂:6-OHDA(Sigma公司);Annxin V-FITC凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司)。

3)仪器:流式细胞仪(FACSCalibur，BD，USA);透射电镜(Philips，EM208S，Holand)。

1.2 方法

1)细胞培养:3株细胞用含10%灭活胎牛血清、青霉素1×105U/L、链霉素0.1 g/L的DMEM完全培养基，置CO2培养箱，37℃、3.5%CO2条件下培养。细胞每周传代2次，根据实验需要将细胞按合适密度接种于培养瓶中。

2)免疫细胞化学染色显示转染细胞Nurr1表达:免疫荧光细胞化学染色一抗为Nurr1抗体(1∶1 000)，二抗为荧光素CY3标记的山羊抗小鼠抗体(1∶200)。免疫细胞化学染色按SP试剂盒说明书进行，用DAB显色。

3)RT-PCR鉴定转染细胞Nurr1 mRNA表达:用TRIzol提取总RNA反转录后行PCR。Nurr1及β-actin引物系根据GenBank中相应基因序列自行设计，由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下:NURR1(299 bp):5'-agtacctttatggacaactacagca-3'和5'-cgtagtggccacgtagttctggt-3';β-actin(540 bp):5'-gtggggcgccccaggcacca-3'和5'-cttccttaatgtcacgcacgatttc-3'。PCR反应条件为:94℃变性5 min后，按94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，扩增28个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳后在紫外灯下观察、照相。

4)流式细胞术(flow cytometry，FCM)测定细胞早期凋亡比例:向对数生长期的细胞分别加入50、75、100 μmol/L 6-OHDA，对照组更换新鲜培养基。分别在6、12 h后结束孵育，收集细胞1×106，1 000 r/min离心5 min，PBS 洗涤，加入 Binding Buffer 150 μL 和Annexin V-FITC 10 μL，室温，避光染色 30 min。再加入PI(50 mg/L)5 μL，避光反应5 min后，立即进行FCM(激发/发射488 nm/530 nm和600 nm)检测早期凋亡。数据采用Cell Quest软件进行分析。实验重复检测4次。

5)透射电镜(transmission electron microscopy，TEM)观察细胞超微结构:向对数生长期的细胞加入75 μmol/L 6-OHDA，对照组更换新鲜培养基。孵育12 h后，收集细胞，洗涤，弃上清，放入预冷的2%多聚甲醛-2.5%戊二醛前固定液(pH 7.4)，4℃固定2 h。二甲砷酸钠缓冲液浸洗，1%锇酸(OSO4)4℃后固定2 h，梯度乙醇脱水，环氧丙烷置换，环氧树脂Epon812包埋。1 μm厚切片用天青美蓝染色作定位，超薄切片经醋酸双氧铀/枸橼酸铅双重染色，TEM观察。

6)Western blotting检测Caspase-3活性前体蛋白表达:细胞接种于25 cm2培养瓶中，培养24 h。向对数生长期的细胞加入含75 μmol/L 6-OHDA的完全培养基，对照组更换新鲜培养基，分别在培养6、12 h后结束孵育，收集细胞，1 000 r/min离心5 min，PBS洗涤。向细胞沉淀中加入细胞裂解液160 μL，超声破碎，用BCA法测定蛋白质浓度。取30 μg样品蛋白，煮沸变性，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(10%分离胶，4%聚集胶)分离蛋白质。取出凝胶，400 mA，冰浴中行电转移3 h。取出硝酸纤维素膜用TBS清洗2次，然后置于封闭液(含10%脱脂奶粉的TTBS)中，室温下封闭1 h。加入一抗，鼠抗人Caspase-3单克隆抗体(1∶500，Santa Cruz)，4 ℃ 过夜，洗膜 3 次，每次 10 min。加入HRP标记的羊抗鼠二抗(1∶4 000)，室温下孵育2 h，洗膜3次，每次10 min。按发光试剂盒(PIERCE公司)说明书显影，用Gel-Doc凝胶成像系统扫描X线，对条带密度进行半定量分析，分别计算出2株细胞经6-OHDA作用不同时间后Caspase-3活性前体蛋白条带与各自正常细胞Caspase-3活性前体蛋白条带的密度比值，得到各实验组Caspase-3活性前体蛋白表达的百分比。统计学处理后，以6-OHDA作用时间为横坐标，Caspase-3活性前体蛋白表达百分比为纵坐标绘制统计分析图。

1.3 统计学方法

采用Sigma plot 10.0统计软件，数据以均数±标准差()表示。应用Two Way ANOVA析因方差法进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞培养

SK-N-SH、SK-N-SH/Nurr1和 SK-N-SH/EGFP 3株细胞形态无明显差异，均呈对数方式增生，SK-NSH/Nurr1细胞增生率最低，SK-N-SH和SK-N-SH/EGFP细胞增生率较为接近［6］。

2.2 Nurr1基因转染细胞的鉴定

免疫细胞化学染色结果显示SK-N-SH和SK-NSH/EGFP细胞Nurr1抗体染色阴性(图1A，1B)，而SK-N-SH/Nurr1细胞传代5次Nurr1抗体染色仍为阳性，其阳性细胞胞核深染，胞质及突起淡染(图1C)。荧光显微镜显示EGFP在SK-N-SH/EGFP细胞高表达(1D)。以上结果说明已成功建立稳定过表达外源性Nurr1基因的SK-N-SH 细胞模型SK-N-SH/Nurr1，质粒转染对nurr1检测无影响。

RT-PCR结果显示未转染Nurr1基因的SK-N-SH细胞检测不到Nurr1 mRNA(图2A)，而转染Nurr1基因的SK-N-SH/Nurr1细胞检测到高水平的NURRr1 mRNA表达(图2B)。

2.3 过表达nurr1基因促进6-OHDA诱导细胞凋亡比例增加

细胞受到凋亡诱导后不久，磷脂酰丝氨酸(phosphatiylserine，PS)从细胞膜内侧转移到外侧，可被荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)标记的钙依赖性磷脂结合蛋白Annexin V特异性地结合［8］。由于PS外露发生早于DNA断裂，联合PI法进行FCM检测，可区分、定量分析4个细胞亚群，包括Annexin V－/PI－的正常细胞亚群(左下象限);Annexin V+/PI－的早期凋亡细胞亚群(右下象限);Annexin V+/PI+的坏死细胞亚群(右上象限)，其中包括凋亡晚期和坏死细胞，以及Annexin V－/PI+的受损细胞亚群(左上象限)。

FCM检测结果显示，正常SK-N-SH和SK-N-SH/Nurr1细胞凋亡或坏死细胞亚群比例均较低(图3-1A，B)。较小剂量 6-OHDA(50 μmol/L)作用 12 h，2株细胞凋亡和坏死细胞亚群比例均没有明显变化(图3-1C，D)。当6-OHDA 浓度升至75 μmol/L作用12 h后，SK-N-SH细胞正常亚群比例仍然较高，凋亡细胞亚群比例在 6-OHDA处理后为3.1% ±0.5%(图3-1A，E)，而SK-N-SH/Nurr1细胞凋亡亚群比例由6-OHDA处理前的1.1% ±0.6%升至10.1% ±1.1%(图3-1B，F)，经统计学分析，2 组细胞凋亡差异显著(P=0.000)。大剂量 6-OHDA(100 μmol/L)作用6 h后，两株细胞凋亡亚群比例比起6-OHDA处理前没有增加(图3-2A，B)，而2株细胞坏死亚群比例均明显上升(图3-2C，D);100 μmol/L 6-OHDA 作用12 h后，SK-N-SH细胞坏死亚群升至18.5% ±1.3%，SK-N-SH/Nurr1细胞坏死亚群升至27.4% ±1.7%，经统计学分析，2株细胞坏死亚群比例差异无统计学意义(P=0.080)，但均较6-OHDA处理前上升显著，差异有统计学意义(P=0.000)，但2株细胞凋亡亚群比例仍然很低，分别为 1.4% ±0.03%和2.2% ±0.17%，差异无统计学意义(P=0.060)(图 3-2E，F)。

图1 免疫组化染色显示Nurr1抗体在SK-N-SH、SK-N-SH/Nurr1和SK-N-SH/EGFP细胞中的表达Fig.1 Immunocytochemical staining results of SK-N-SH，SK-N-SH/Nurr1 and SK-N-SH/EGFP cells with Nurr1 antibody(original magnification 400×)

图2 RT-PCR法检测Nurr1 mRNA在SK-N-SH和SK-N-SH/Nurr1细胞中的表达Fig.2 Nurr1 mRNA in SK-N-SH and SK-N-SH/Nurr1 cells was detected by RT-PCR analysis

2.4 过表达nurr1基因促进6-OHDA诱导细胞凋亡形态改变

TEM观察，正常SK-N-SH和SK-N-SH/Nurr1细胞微绒毛丰富，胞膜完整，线粒体较少，内质网表面有多聚核糖体附着，有核异型现象(图4-1A，B，图4-2A，B)。75 μmol/L 6-OHDA 作用12 h，SK-N-SH 细胞以坏死为主，表现为细胞体肿胀，胞膜崩解，粗面内质网扩张、脱颗粒，线粒体嵴断裂、消失或呈空泡化改变，胞质及胞核内电子密度普遍降低，核内染色质溶解，胞质内可见髓样小体(图4-1C，D)，而SK-N-SH/Nurr1细胞出现典型的凋亡形态学改变，表现为细胞形态不规则，细胞膜完整，胞质减少，线粒体基本正常，核内染色质凝集成块状并有边集现象，电子密度明显增加。个别处于凋亡晚期的细胞核可见染色质进一步凝聚，聚集成染色质小块或呈新月形(图4-2C，D)。

2.5 6-OHDA诱导SK-N-SH细胞Caspase-3活性前体蛋白激活

Western blotting印迹结果显示，正常的SK-N-SH和SK-N-SH/Nurr1细胞，在泳道上的32 000处均出现了特异蛋白条带，肉眼观察条带的面积和着色无明显差别。75 μmol/L 6-OHDA 分别作用6、12 h，SK-N-SH细胞各实验组在泳道上的32 000处的条带面积以及着色变化不明显，说明Caspase-3活性前体蛋白表达基本不变。而 SK-N-SH/Nurr1细胞在75 μmol/L 6-OHDA分别作用6、12 h后，各实验组泳道上的32 000处的条带着色随6-OHDA作用时间延长而逐渐减弱(图5 A，B)，说明Caspase-3活性前体蛋白表达随6-OHDA作用时间延长而明显下降。用Gel Doc凝胶成像系统进行光密度值分析，并经统计学处理，显示75 μmol/L 6-OHDA 作用 6、12 h，SK-N-SH/Nurr1 细胞Caspase-3活性前体蛋白表达显著低于SK-N-SH细胞(P=0.010)(图6)。

图4-1 75 μmol/L 6-OHDA作用12 h，经透射电镜观察SK-N-SH细胞超微结构Fig.4-1 The ultrastructural changes of SK-N-SH cells were observed by TEM after treatment with 75 μmol/L 6-OHDA for 12 h

3 讨论

本研究通过比较人神经母细胞瘤细胞株SK-NSH细胞和过表达外源性 nurr1基因的SK-N-SH/Nurr1细胞对神经毒素6-OHDA损伤的不同反应，研究过表达中脑特异性转录因子nurr1基因在6-OHDA选择性诱导DA能神经元凋亡中的作用。经6-OHDA作用，2株细胞表现出了不同的病理损伤特征，并且具有毒素剂量、作用时间依赖性:细胞超微结构以及AnnexinV/PI双染联合FCM检测均显示，75 μmol/L 6-OHDA作用12 h，SK-N-SH/Nurr1细胞凋亡比例显著上升，而SK-N-SH细胞主要表现为细胞毒性坏死;大剂量6-OHDA(100 μmol/L)作用不同时间，SK-N-SH和SK-N-SH/Nurr1细胞均表现为坏死。可见，6-OHDA诱发SK-N-SH和SK-N-SH/Nurr1细胞死亡存在细胞凋亡和坏死两条不同途径，在75 μmol/L 6-OHDA作用下，nurr1基因主要激活SK-N-SH/Nurr1细胞凋亡通路，说明6-OHDA的致凋亡作用与细胞种类和剂量相关。体外实验［9］显示，6-OHDA能诱导中脑 DA能神经元、儿茶酚胺细胞系PC12细胞及中脑源性DA能细胞系MN9D等细胞凋亡。Walkinshaw G等［10］最早报道低浓度的6-OHDA(≤100 μmol/L)能诱导PC12出现具有明显生化和形态特征的凋亡，但高浓度的6-OHDA主要诱导细胞毒性损伤，与我们的实验结论一致。

图6 75 μmol/L 6-OHDA 分别作用6、12h，SK-N-SH 和SK-N-SH/Nurr1细胞Caspase-3活性前体蛋白表达的变化Fig.6 Comparison of pro-Caspase-3 in SK-N-SH and SK-N-SH/Nurr1 cells treated with 75 μmol/L 6-OHDA for 6、12 h

在体外，过表达nurr1基因可促进前体细胞向DA能神经元分化，如在过表达nurr1的成年海马前体细胞，nurr1可直接与酪氨酸羟化酶 (tyrosine hydroxylase，TH)基因的启动子结合，在不引起神经元分化的情况下激活th转录［11］;若将过表达nurr1的C17.2细胞与腹侧中脑来源的Ⅰ型星型胶质细胞共培养，则可诱导大量的 th阳性神经元产生［12］;我们也已经报道［7］，过表达nurr1基因的 SK-N-SH/Nurr1细胞能表达成熟神经元的特异性标识物-微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP-2)，证明外源性nurr1基因过表达可促进SK-N-SH细胞向成熟神经元方向分化。以上研究表明nurr1表达与DA能神经元的表型关系密切，经6-OHDA作用后，DA能神经元死亡形式可能与nurr1基因存在某些关联。

Nurr1及其相关基因nurr1、nor-1共同组成核受体超家族中的NURR77亚家族，该亚家族成员由即早基因编码［13］，各种刺激如生长因子、细胞因子、缺血等都能引起这些基因快速短暂的表达上调［14］，参与细胞生存、增生以及凋亡过程。nurr1对凋亡过程的调节还不甚明了，但是nur77调节T细胞和肿瘤细胞凋亡通路研究较为深入［15-17］。nur77可以上调促凋亡基因如Fas配体、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)［18-20］。信号传导因子JNK的激活以及Akt的抑制可促使nur77由细胞核转移至细胞质［21］，与线粒体Bcl-2组成凋亡前体复合物刺激凋亡反应［22-23］。此外，PKC的活化可导致nur77表达上调，对T细胞受体信号诱导胸腺细胞凋亡起到重要作用［24］。

研究［25］发现，在PD病人和动物模型的中脑黑质致密部，Caspase-3，作为神经元凋亡的重要调控因子，其前体蛋白被激活的DA能神经元显著增加。存在急慢性神经退行性疾病的实验动物，其病理改变检测到Caspase-3的激活，尤其在使用6-OHDA诱发PD后，Caspase-3前体蛋白激活后诱发凋亡过程。

由此，我们推测作为转录因子，nurr1基因可能具有调节不同信号传导通路的作用，最终是否激活Caspase-3途径，关系到细胞坏死、凋亡或免受损伤等不同结局，相关分子机制有待进一步研究。

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