产细菌素乳酸菌的分离与筛选

河北科技大学生物科学与工程学院 韩雪

河北省兽药监察所 李研东

黑龙江八一农垦大学食品学院 王 颖

乳酸菌是一种在食品发酵工业和微生态制剂中广泛应用的益生菌。它可以抑制或杀死一些病原菌和腐败菌，有利于人和动物的健康。细菌素是乳酸菌发挥益生作用的主要物质。因其具有高效、无毒、无残留、无抗药性等优点，已成为抗生素有效的替代物（周志江等，2006）。本试验旨在筛选产广谱细菌素乳酸菌菌株，为细菌素联合物或细菌素与其他抗菌剂联合使用创造条件，弥补使用单一细菌素的缺陷和不足。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 乳酸菌来源 君乐宝酸奶、完达山老酸奶、槐茂酱菜、灵生阿里郎韩国泡菜（市售）；10份东北发酵酸白菜（自制）。

1.1.2 试验菌株 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌为河北科技大学生物科学与工程学院保留菌种。

1.1.3 TGE培养基 蒸馏水 1000 mL、pH值为6.5、蛋白胨 10.00 g、酵母浸提物 4.00 g、牛肉膏6.00 g、葡萄糖10.00 g、硫酸锰0.05 g、硫酸镁0.10 g、吐温 80 0.2%，0.08 Mpa灭菌 30 min（韩雪和周志江，2006）。

1.2 产抑菌物质乳酸菌的分离 沾取原料液于TGE固体培养基上划线培养，37℃静置培养48 h。用接种环挑取单菌落接种于TGE液体培养基，37℃，培养48 h。发酵液10000 r/min离心15 min，取上清，用软琼脂扩散法验证发酵上清液的抑菌效果。

平板底层平铺薄薄一层固体TGE培养基，再将10 mL含有l06CFU大肠杆菌/枯草芽孢杆菌的软琼脂平铺在固体TGE上，用打孔器在铺好培养基的平板上打直径为5 mm的孔，取发酵上清100 μL加入到孔中，37℃静置培养24 h后，检查平板上形成的抑菌圈。

1.3 产抑菌物质乳酸菌的鉴定 挑选形成抑菌圈的菌株做革兰氏染色，观察菌体形态和染色特征，进行过氧化氢酶试验、耐热试验。厌氧或兼性厌氧的G+无芽孢菌，过氧化氢酶阴性，初步认定为乳酸菌。

1.4 抑菌物质为乳酸菌细菌素的初步确定

1.4.1 酸抑菌作用排除 为了排除乳酸菌代谢产物中有机酸对抑菌效果的影响，将5株乳酸菌发酵液上清液的pH调至中性后再进行抑菌试验。乳酸菌发酵液10000 r/min离心15 min，取上清液，测其pH值，用l mol/L NaOH和l mol/L HCl将上清液调至pH值6.0，以大肠杆菌为指示菌，pH 6.0的乳酸溶液为对照，用软琼脂扩散法验证中性上清液的抑菌效果。

1.4.2 过氧化氢抑菌作用排除 为排除过氧化氢对抑菌物质抑菌作用的影响，将5株乳酸菌发酵上清液用过氧化氢酶处理，未经处理的发酵上清为对照，大肠杆菌为指示菌，用软琼脂扩散法验证上清液的抑菌效果。

1.5 细菌素性质初步确定 采用软琼脂扩散法检测酶、温度、有机溶剂对细菌素抗菌活性的影响。为检测不同酶对细菌素抗菌活性的影响，将发酵上清液调到pH 7.0，加胰蛋白酶、蛋白酶K、α-胰凝乳酶、胃蛋白酶、DNA酶、脂肪酶和过氧化氢酶至终浓度0.5 mg/mL，37℃作用1 h，然后测定抑菌活性。

将发酵上清液分别置 60、80、100、121 ℃处理15 min，检测细菌素对热的耐受力。

将发酵上清液按1∶2的比例分别加入甲醛、乙醇、丙酮，室温下处理2 h后，对混合液进行真空蒸馏处理以除掉有机溶剂。检测细菌素对有机溶剂的耐受力。

2 结果与分析

2.1 产细菌素乳酸菌的分离 对4份市售乳酸菌来源材料和10份自制酸白菜样品进行了试验，每个样品划线培养至长出明显的单菌落，挑选5个单菌落进行液体培养后取上清液做抑菌试验。本试验分别从槐茂酱菜（L1）、灵生韩国泡菜（L2）、完达山老酸奶（L3）中各分离出一株、从东北酸白菜中分离出两株（L4、L5）具有抑菌活性（同时抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）的菌株。

2.2 产细菌素乳酸菌的鉴定 对分离出有抑菌活性的菌株做形态学和生化试验。5个菌株的菌落形态均为圆形、凸起、边缘整齐、表面光滑、乳白色、不透明的光滑型菌落，革兰氏染色阳性菌，不运动、无芽孢。生化试验结果显示，5个菌株均为厌氧或兼性厌氧，过氧化氢酶阴性。初步确定该5株菌为乳酸菌。

2.3 细菌素抑菌干扰因素排除

2.3.1 排除有机酸的影响 将发酵上清液pH调至6.0后，与对照组比，对照pH 6.0对指示菌已经没有作用，而pH 6.0的发酵上清液对指示菌仍有抑制作用，可见排除pH干扰后，发酵液中还存在其他抑菌活性物质。

2.3.2 排除过氧化氢的影响 L1～L5菌株的浓缩上清液经过氧化氢酶处理后，抑菌圈直径和浓缩上清原液的抑菌圈直径相比变化不大（见表1），从而可以证明菌株和发酵液中的抑菌物质不完全是过氧化氢，还有另外的抑菌物质对指示菌有抑制作用。

表1 排除过氧化氢影响抑菌结果 mm

2.4 抑菌物质性质初步确定 试验结果显示：加蛋白酶K和胰蛋白酶后抑菌物质的活性消失，而加入过氧化氢酶、脂肪酶和DNA酶不能使其失活（见表 2）。 将提取物溶液分别置 60、80、100、121℃处理15 min后，抑菌物质仍保持活性（见表3）。有机溶剂甲醛、乙醇、丙酮均不影响抑菌物质的抑菌活性（见表4）。

表2 抑菌物质对酶的敏感性

表3 抑菌物质对温度的敏感性

表4 抑菌物质对有机溶剂的敏感性

3 结论

乳酸菌种类繁多，被广泛应用于乳制品、发酵植物食品如泡菜、酸菜和青贮饲料等。其产生的乳酸菌素亦被广泛用于食品、饲料的保鲜防腐等方面（Fernandez等，2004）。本试验通过对不同来源材料中乳酸菌的分离鉴定，初步筛选出五株对大肠杆菌（G-）和枯草芽孢杆菌（G+）均具有较强抑制作用的菌株。该5株乳酸菌代谢产生的乳酸菌素对非蛋白酶类、温度和有机溶剂均不敏感，表现出了良好的理化性质。本试验将进一步研究5株乳酸菌的生物学特性、安全性、抑菌范围、抑菌物质产量，为其在食品保鲜防腐方面的应用提供依据。

[1]韩雪，周志江.乳酸片球菌细菌素的活性及特性的研究[J].食品研究与开发，2006，27（4）：19 ～21.

[2]周志江，韩烨，韩雪，等.从酸白菜中分离出一株产细菌素的乳酸片球菌[J].食品科学，2006，27（4）：89 ～92.

[3]Fernandez A，Horn N，Gasson M J，et al.Rodriguez J M.High-level coproduction of the bacteriocins nisin A and lactococcin A by Lactococcus lactis[J].Journal of Dairy Research，2004，71：216 ～221.