酪蛋白磷酸肽的酶水解条件研究

轩诗海1 张铁涛2

（1 黑龙江省完达山乳业股份有限公司 2 琼州学院化学系）

近年来，生物活性肽作为保健食品市场的新生力量显示出了强大的市场潜力。乳源性生物活性肽是生物活性肽中最重要的一类，乳源性生物活性肽的种类繁多，目前已发现的有阿片肽、免疫促进肽、阿片拮抗肽、抗高血压肽、抗血栓肽、酪蛋白磷酸肽和其它一些生物活性肽［1,2］，其中酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptides，CPPs）是发现较早的一种，酪蛋白磷酸肽是蛋白酶水解酪蛋白后形成的一种含成簇磷酸丝氨酸基团的生物活性短肽，因其具有促进矿物质吸收，特别是钙质吸收等多种生物活性而倍受关注。本研究主要是以粗制的干酪素为原料，采用四因素三水平L9（34）正交试验，确定碱性蛋白酶水解干酪素制备酪蛋白磷酸肽的最佳工艺条件［3,4,5］。

1 材料与方法

1.1 原料与主要试剂

本试验所用的原料是甘肃华羚乳品集团公司工业精一级干酪素，颜色呈淡黄色，其主要成分见表1-1，其它化学试剂均为分析纯。

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1.2 碱性蛋白酶水解干酪素制备CPPs单因素试验

为了确定正交试验各因素的水平范围，以水解度为指标，对影响蛋白酶水解的[E]/[S]、pH、温度和时间做单因素分析。

1.2.1 [E]/[S]对水解度影响

固定底物浓度为15%，pH为9.0，温度为50℃，水解时间为2.0 h。选取[E]/[S]为 400 u/g～2000 u/g（相差为400 u/g），对底物进行水解。

1.2.2 pH对水解度影响

固定底物浓度为15%，[E]/[S]为800 u/g，温度为50℃，水解时间为2.0 h。选取pH为9.0～11.0（相差为0.5），对底物进行水解。

1.2.3 温度对水解度的影响

固定底物浓度为15%，[E]/[S]为800 u/g，pH为9.0，水解时间为2.0 h。选取温度为40℃～60℃（相差为5℃），对底物进行水解。

1.2.4 水解时间对水解度的影响

固定底物浓度为15%，[E]/[S]为800 u/g，pH为9.0，温度为50℃。选取水解时间为1.0 h～3.0 h（相差为0.5 h），对底物进行水解。

1.3 最佳水解条件的选择

根据单因素试验，固定底物浓度为15%，按表1-2设计四因素三水平正交实验方案，在不同[E]/[S]、水解温度、反应pH和水解时间的条件下对底物进行水解，根据CPPs的N/P来确定最佳水解条件。到达预定反应时间后，立即将反应器置于沸水浴中5 min，以终止水解反应。

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2 结果与讨论

2.1 碱性蛋白酶水解干酪素制备CPPs单因素实验分析

2.1.1 [E]/[S]对水解度影响

用碱性蛋白酶水解酪蛋白溶液，水解条件为底物浓度15%、温度50℃、pH 9.0、时间2.0 h，[E]/[S]分别为400 u/g、800 u/g、1200 u/g、1600 u/g、2000 u/g。以不同[E]/[S]为横坐标，所消耗的0.1mol/LNaOH的体积为纵坐标绘制曲线，见图2-1。

从图2-1看出，随着[E]/[S]的升高，水解度也不断增大，但是当酶浓度达到一定的数值时，水解度不再升高，而是趋于平缓，也就是说底物与酶的结合位点已达到饱和，即使增加酶量也没有底物与之结合。

2.1.2 pH对水解度影响

用碱性蛋白酶水解酪蛋白溶液，水解条件为底物浓度15%、[E]/[S]800 u/g、温度50℃、时间2.0 h，pH分别为9.0、9.5、10.0、10.5、11.0。以pH为横坐标，所消耗的0.1mol/LNaOH的体积为纵坐标绘制曲线，见图2-2。

从图2-2看出，pH小于10时，水解度随pH增大而不断增大，pH大于10时，水解度随pH增大而不断减少，在pH等于10，水解度最大，说明其最适pH为10。

2.1.3 温度对水解度影响

用碱性蛋白酶水解酪蛋白溶液，水解条件为底物浓度15%、[E]/[S]800u/g、pH 9.0、时间2.0 h，水解温度分别为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃。以水解温度为横坐标，所消耗的0.1mol/LNaOH的体积为纵坐标绘制曲线，见图2-3。

从图2-3看出，随着水解温度的升高，水解度也增加，当温度达到55℃时，水解度不再升高并趋于平缓，也就是说将反应温度维持在55℃～60℃，酶活力能保持最高值。

2.1.4 时间对水解度影响

用碱性蛋白酶水解酪蛋白溶液，水解条件为底物浓度15%、[E]/[S]800u/g、温度50℃、pH 9.0，水解时间分别为1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h。以水解时间为横坐标，所消耗NaOH的体积为纵坐标绘制曲线，见图2-4。

从图2-4可看出，随着水解时间的增加，水解度持续增加，当水解2.5 h后，水解度不再升高并趋于平缓，这时候酶对蛋白质的水解减缓，酶活力下降，这时应终止水解反应。

从单因素的实验中我们可以看出，对碱性蛋白酶来说，最有利于它进行水解的条件为[E]/[S]为1200 u/g、pH 10、温度55℃、水解时间为2.5 h。

2.2 碱性蛋白酶制备CPPs最佳条件的确定

做为CPPs产品优劣的评定指标，N/P摩尔比比较客观地反映出磷酸丝氨酸基团在多肽中的密度，其值越小，磷酸丝氨酸基团的密度越大，肽链越短，产品纯度越高，其结合矿物质离子的能力就越强。以N/P值为指标，用四因素三水平的正交实验确定其最佳水解条件，试验结果见表2-1，结果分析见表2-1。

从表2-1可以看出各因素对N/P摩尔比影响的大小顺序为：B>D>A>C。最终确定水解条件的最优组合为A3B1C3D1，即最佳反应条件为：温度55℃、pH9.0、时间2.5h、酶浓度800u/g。经验证性试验得出，在此条件下得到的CPPs的N/P比为4.371，产率为12.88%。

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3 结论

由单因素实验分析结果及四因素三水平L9（34）正交试验，确定用碱性蛋白酶从水解的原料—劣质干酪素中提取酪蛋白的最佳反应条件是温度55℃、pH 9.0、时间4.0 h、原料浓度为15%。由方差分析可知，选定的四个因素在其相应的水平范围内对试验的影响都不太大，因此在原则上，试验进行时这四个因素只需控制在其相应的水平范围内即可。

[1] 蔡为荣, 薛正莲.生物活性肽－酪蛋白磷酸肽（CPP）的研制[J].食品科学, 2001, 22(4):52～54

[2] 冯杰龙, 林炜铁, 徐晓飞, 姚汝华.生物活性肽及其蛋白酶水解法制备探索[J].广州食品工业科技, 2002, 18(3):36～38

[3] 陈庆森, 庞广昌, 林康艺, 胡志和, 刘剑虹, 阎亚丽.固定化碱性蛋白酶生产CPP的研究[J].食品科学, 2000, 21(1):25～28

[4] 刘剑虹, 庞广昌, 于金华, 张晓玲, 陈庆森, 胡志和.酪蛋白磷酸肽(CPPs)的纯化研究[J].食品科学, 2001, 22(4):31～35

[5] 庞广昌, 胡志和, 陈庆森, 刘剑虹.利用2709碱性蛋白酶水解酪蛋白制备CPPs的研究[J].食品科学, 2000,21(12):34～35