新抗原基因MLAA-34在急性单核细胞白血病患者的表达及意义

赵建强， 张王刚， 何爱丽， 张文娟， 古流芳 (西安交通大学医学院第二附属医院血液内科， 西安 710004)

急性单核细胞白血病(AML-M5)是急性髓性白血病中较常见的类型，临床特征突出表现为髓外病变、高白细胞计数、完全缓解率低、无病存活时间短。1998年欧洲11q23异常协作组(11q23 EUW)报道，约80%11q23异常AML患者为M4/M5亚型，证实11q23异常与单核细胞分化密切相关［1］。虽然11q23异常与M5明显相关，但11q23异常在M5中的发生率仅6% －8%，且迄今已报道MLL基因受累的11q23染色体易位有75种，克隆到MLL基因的伙伴基因39个［2］;这些结果提示检测发生重排的MLL基因只适用于极少数的M5患者。迄今为止对急性单核细胞白血病(M5)尚未找到其他确定的特异分子标记物。为筛选和鉴定出急性单核细胞白血病表达率高、特异性强的白血病相关抗原，我们成功构建了M5的cDNA表达文库，通过SEREX法筛选出35条与AML-M5抗原相关的基因［3］。应用高通量ELISA(crELISA)技术对这些抗原新基因进行抗体特异性表达的小样本检测，鉴定出具有特异性抗体、阳性率高的M5抗原新基因MLAA-34［3］，通过生物信息学分析发现:MLAA-34基因是功能未知基因CAB39L的一个新的剪接变体［4］;应用RNAi技术研究发现MLAA-34基因是和急性单核细胞白血病发生相关的新的抗凋亡分子［4］。

MLAA-34在急性髓细胞白血病尤其在AML-M5的表达模式迄今还不是十分明确，本研究旨在构建敏感而且可靠的荧光定量 RT-PCR方法，检测MLAA-34基因在AML-M5患者中表达水平的变化，分析其与AML-M5化疗缓解、复发及预后的关系，探讨其在临床的应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取自2008－01～2010－01间在西安交通大学医学院第二附属医院血液内科收治的初诊的患者，AML-M5患者35例，非AML-M5急性髓细胞白血病患者40例，经临床、骨髓形态学及组织化学染色及免疫分型检查确诊，部分病例还进行了染色体核型分析。男性43例，女性32例;年龄18－71岁，中位年龄46岁。同时期非恶性血液系统疾病患者骨髓标本12例，健康志愿者外周血单个核细胞来自本院健康教职工和学生共10例作为正常对照。来自本院血液科实验室冷冻保存的人急性单核细胞白血病细胞系U937作为阳性对照。骨髓及外周血单个核细胞收集后－80℃留存备用，所有人员均获知情同意并签署书面同意书。

1.2 诱导治疗方案、疗效的判定及疗效的观察

AML-M3由于其不同于其他亚型AML的特殊发病机制采用全反式维甲酸和/或砷剂的标准方案诱导治疗［5］。除 AML-M3之外的低危 AML化疗方案:MAE(米托蒽醌+阿糖胞苷+依托泊苷)、HA(高三尖杉酯碱+阿糖胞苷);高危AML化疗方案:MAED(米托蒽醌+阿糖胞苷+依托泊苷+地塞米松)、MMED(米托蒽醌+甲氨蝶呤+依托泊苷+地塞米松)。诱导缓解治疗及第一个化疗疗程不足的患者，视为放弃治疗;诱导缓解治疗完成及第一个化疗疗程后观察疗效及缓解率，纳入统计指标。疗效观察按照张之南等的血液病诊断及疗效标准［6］，分为完全缓解(CR)，部分缓解(PR)和未缓解(NR)三组。随访时间为180 d。白血病复发的诊断指标是:骨髓白血病细胞＞5%，但＜20%，经有效的抗白血病治疗一个疗程仍未达CR者;骨髓白血病细胞＞20%;或临床出现髓外白血病浸润(骨髓及血象仍正常)三项之一。

1.3 主要试剂 淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque)购自上海试剂二厂;Trizol试剂购自Invitrogen公司;RNA反转录试剂盒One Step RNA PCR Kit购自大连Takara公司;pMD18-T载体购自Promega Biotech公司。

1.4 方法 应用 RT-PCR方法对 AML-M5、非 M5的AML、非白血病的其他血液疾病患者及正常对照的MLAA-34 mRNA的表达水平分别进行检测并加以比较。对AML-M5患者不同病程阶段(初诊、完全缓解、部分缓解或未缓解及复发)的MLAA-34 mRNA的表达水平进行检测并分析。同时对部分AML-M5患者的MLAA-34 mRNA表达水平进行了动态监测。

1.4.1 骨髓及外周血单个核细胞(PBMC)的分离、RNA提取 EDTA抗凝的骨髓液2－3 ml或外周血5 ml在离心管中加入等量的淋巴细胞分离液，1 200 r/min离心20 min后，小心提取中间云雾状白色单个核细胞层，PBS洗涤2次;如红细胞及血小板较多，可加入红细胞裂解液1 ml充分混匀后离心;Trizol提取细胞总RNA，经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量及浓度。

1.4.2 cDNA的合成 按照RNA反转录试剂盒的说明进行，逆转录体系 20 μl包括总 RNA 1 μg，Oligo(dT)引物 50 μmol/L，RNA 酶抑制剂 20 U，5 ×MMLV缓冲液2 μl，MMLV逆转录酶200 U。70℃10 min，42℃ 1 h，70℃ 15 min冰上冷却终止反应。

1.4.3 PCR引物及探针 目的基因 MLAA-34、管家基因β-actin引物根据DNA序列设计，并经过美国生物技术信息中心(NCBI)提供的BLAST程序验证其特异性，MLAA-34基因的引物、探针及阳性标准品均由广东中山大学达安基因公司设计并合成。管家基因β-actin的引物及探针由Takara公司合成。MLAA-34引物序列:上游为5'－AAG CCG GAG AAC CTG AAA CTC －3'，下游为5'－TGA GGA CTG GCC ACA AAC AC－3'，探针序列为5'－FAM －TGA TGA ACC TCC TTC GGG ATA AAA GTATAMRA－3';β-actin引物序列:上游为 5'－TCC TTC CTG GGT ATG GAATC －3'，下游为 5'－GCA CTG TGT TGG CAT AGA GG －3'，探针序列为5'－FAM－CGG ATG TCA ACG TCA CAC TTC ATGATAMRA －3'。

1.4.4 实时荧光RT-PCR检测 建立阳性标准品:以高表达MLAA-34的人急性单核细胞白血病细胞系U937为对象，提取其总RNA、反转录、PCR特异性扩增MLAA-34、β-actin基因片段，连接入pMD18-T载体，测序，构建含有MLAA-34、β-actin基因片段的阳性重组质粒，扩增，确定其拷贝数浓度;多重实时荧光定量RT-PCR条件的优化:对MLAA-34、βactin引物进行 5×106，10×106，20×106pmol/L 3种不同浓度的测试，以确定在实时荧光定量仪上进行反应时产生的信号效果;设定探针浓度为50，100，200 nmol/L，以优化反应条件，并选择能产生最高信号强度且无非特异性扩增的最适探针浓度;构建标准曲线:将经测序证明为阳性的重组质粒进行倍比稀释，分别稀释成拷贝数为 104，105，106，107，108，109/μl，构建 MLAA-34、β-actin 的标准曲线，并确定模板数的最佳线性范围，已使模板在上述拷贝数范围之间，与相应的Ct值具有良好的相关性;MLAA-34的PCR反应体系:5×定量 Buffer 10 μl，上下游引物、探针各 1 μl，dNTP、Taq 酶各 1 μl，cDNA 5 μl，加双蒸水 30 μl使反应总体系为 50 μl。反应条件为:93℃ 2 min，然后93℃ 30 s，55℃ 1 min，共40个循环。反应结束后，任选4－5个阳性模板标准梯度点分析，若相关系数r＞0.97，表明线性关系良好，可确定为标准曲线，根据标准曲线得出样本荧光定量反应的绝对定量值，定量的单位按拷贝数/μl cDNA计算。每份标本均进行复管检测，取其均值作为MLAA-34的表达水平。β-actin基因的RTPCR体系及反应条件同MLAA-34，反应40个循环。1.5 统计学分析 计量资料呈非正态分布，用中位数(M)描述，采用Kruskal Wallis test及Mann-Whitney test检验分析各组间差异，应用SPSS16.0统计分析软件，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组间MLAA-34 mRNA表达比较 结果显示，MLAA-34在AML-M5组表达显著高于正常对照组、非恶性血液疾病组及非AML-M5组的表达，差异具有统计学意义(P＜0.05，见表1)。

表1 不同组别MLAA-34 MRNA的表达水平Tab 1 Expression of MLAA-34 MRNA in different groups

2.2 MLAA-34 mRNA在AML-M5患者不同病程阶段的表达 如表2所示，初治AML-M5患者MLAA-34 mRNA表达水平明显高于正常对照组(P＜0.05)。AML-M5复发患者MLAA-34 mRNA表达水平明显高于正常对照组(P＜0.05)，略高于AMLM5初治组，差异无统计学意义(P＞0.05)。初治AML-M5患者经诱导化疗获得完全缓解(CR)的患者MLAA-34 mRNA表达水平较治疗前明显下降(P＜0.05)，但仍高于正常对照组，差异无统计学意义。

表2 MLAA-34 mRNA在AML-M5的表达水平Tab 2 Expression level of MLAA-34 mRNA in AML-M5 patients

2.3 MLAA-34基因表达与诱导治疗疗效的关系初治75例AML患者中，12例未能完成首疗程治疗或放弃治疗，余63例(AML-M5 30例，non-M5 33例)患者化疗一个疗程后完全缓解42例，完全缓解率为65.8%。完全缓解(CR)组与部分缓解(PR)及未缓解(NR)组MLAA-34表达水平分别为1.86×10－3和6.32 ×102，二者比较差异具有统计学意义(P ＜0.05)。

2.4 MLAA-34基因mRNA表达水平的动态监测结果 对13例AML-M5患者进行动态监测发现，初诊AML-M5时MLAA-34呈高度表达者，CR后MLAA-34表达水平可下降1个数量级以上，未达到缓解的患者其MLAA-34表达水平下降不显著，维持在较高的水平。在复发的8例M5患者中，5例患者初诊化疗前MLAA-34表达水平较高，化疗后达完全缓解后MLAA-34表达水平显著下降，CR后180 d内血象及骨髓象提示复发，检测其MLAA-34表达水平也再次上升(图1A);而其余3例M5患者初诊时MLAA-34表达水平较高，CR后迅速或缓慢下降一个数量级，临床复发前90 d，血象及骨髓象复查处于缓解期，而MLAA-34表达水平却具有上升趋势，之后才出现临床复发(图1B)。

图1 动态监测MLAA-34基因mRNA表达水平Fig 1 MLAA-34 expression levels in the patients with clinical relapse

3 讨论

急性单核细胞白血病相关抗原新基因MLAA-34 cDNA全长1 671 bp，用生物信息学方法分析，其有完整的ORF框，编码一个含有337个氨基酸残基的蛋白质;MLAA-34定位于13q14.2，在此基因座位上，存在一个基因钙结合蛋白39(calcium binding protein 39-like，CAB39L)，而 CAB39L 是一个功能未知的新基因。应用RNAi技术研究发现MLAA-34基因是和急性单核细胞白血病发生相关的一个新的抗凋亡分子。

本研究采用特异的TaqMan探针来定量PCR，TaqMan探针与PCR引物对内侧的一段序列同源，并在5'端连接一个报告荧光(如FAM)，而在3'端连接一个淬灭荧光(如TAMRA)，当此探针保持完整时，报告荧光释放的荧光能被淬灭荧光所吸收，因此检测不到报告荧光的荧光信号。PCR扩增中Taq-Man探针结合于靶分子上，引物延伸过程中，由于TaqDNA聚合酶5'－3'外切核酸酶活性使得TaqMan探针被水解，报告荧光和淬灭荧光分离，从而使报告荧光信号能被检测到，并随着PCR循环次数的增加荧光信号也增加，通过构建已知拷贝数的系列标准品的标准曲线就可以达到定量未知标本的目的。TAMRA在PCR过程中的变化很小，所以检测过程中的荧光信号很稳定，从而提高了检测的重复性［7］。目前，临床上已广泛应用实时荧光定量PCR技术检测白血病标志分子慢性粒细胞白血病(BCRABL)［8］、急性粒细胞白血病部分分化型(AML1-ETO)［9］、急性粒细胞白血病(PML-RARα)［10］、T 细胞性急性淋巴细胞白血病(HOX11)［11］等以进行相应类型白血病的分子诊断、疗效判断及微小残留病的检测等。

对AML-M5患者35例，非AML-M5急性髓细胞白血病患者40例，非恶性血液系统疾病患者12例和健康正常对照10例外周血单个核细胞的MLAA-34表达检测的结果显示，MLAA-34在初诊AML-M5患者其基因表达水平显著高于对照组，与我们先期应用SYBR GreenⅠ荧光染料法的实时荧光定量RTPCR技术对急性单核细胞白血病检测发现MLAA-34基因mRNA在AML-M5型白血病细胞中是特异性高表达的结果是一致的，表明该基因在AML-M5中的表达具有较高的特异性，可代表一种白血病候选标志，用于临床鉴别诊断或疾病的筛查。另外，本研究通过检测AML－M5不同阶段MLAA-34基因表达水平，发现初诊组和复发组显著高于缓解组及正常对照组，复发组与正常对照组间差异亦有统计学意义，说明监测MLAA-34基因变化对于了解病情、判断预后有指导意义。跟踪观察13例M5患者，发现持续血液学CR患者MLAA-34基因表达水平在正常范围或附近波动;MLAA-34基因表达水平明显高于正常或持续增高均提示复发。虽在较低水平但在略超出正常水平波动的患者是否以后易复发，有待进一步观察。MLAA-34 mRNA水平能够很好地显示疗效并预测病情进展:治疗过程中随着白血病细胞比例的减少，MLAA-34 mRNA的水平亦随之下降;发生临床复发的患者复发前MLAA-34 mRNA始终维持在正常水平以上或有逐步上升超出正常的过程。因此，MLAA-34 mRNA水平能够反映白血病负荷，作为临床治疗决定、疗效判断的一项指标。

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