鲤鱼骨酶解工艺的优化

朱迎春,郭丽,王琪钰

(山西农业大学食品科学与工程学院,山西太谷 030801)

鲤鱼在加工过程中会产生40%左右的下脚料,其中鱼头占30%,鱼骨占10%。以前鱼头除少量加工成饲料外,大部分丢弃,未能得到充分利用,既浪费了资源,又污染了环境。如果能充分利用这些下脚料,不仅可提高鲤鱼利用的附加值,而且可减少环境污染,开创良好的经济与社会效益[1]。

鱼骨中蛋白质含量丰富,免疫活性肽、降血压肽和抗菌肽等活性物质以非活性形式隐藏于骨蛋白的氨基酸序列中,在适当条件下即可以释放出来,发挥其生理学作用,因此,将骨蛋白适当酶解,制备对人体安全、无毒副作用的活性肽是可行的[2]。酶法水解骨蛋白已成为蛋白质酶解领域的一个重要分支,国内外越来越多的研究者对此进行了逐步深入的研究和探索。据报道Benjakul[3]研究了牙鳕废弃物的酶解利用,将其废弃物绞碎,分别用中性和碱性蛋白酶水解,选择了最优酶和最佳水解条件,所得产物蛋白质含量高达79.97%,氨基酸组成与鱼肌肉十分相近;许庆陵等[4]对鲢鱼头酶解制备ACE抑制肽,结果表明胃蛋白酶为酶解鲢鱼头制备ACE抑制肽的理想蛋白酶,并确定了最佳酶解工艺条件。

鲤鱼的酶解工艺研究有一些报道,殷金莲等[5]对鲤鱼酶解液化技术进行了研究,确定了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶酶解鲤鱼的最佳条件及酶解效果;盘赛昆等[6]对鲤鱼肉的酶解工艺做了研究并测定了酶解物质对Fenton体系产生的羟自由基的清除效果,结果表明复合蛋白酶效果最佳;徐怀德等[7]对鲤鱼酶解发酵制饮料的加工技术进行了研究,结果表明枯草杆菌蛋白酶为最佳用酶。但是,有关鲤鱼骨酶解工艺的研究还未见报道。本试验在前期预处理的基础上,用不同的有机溶剂对鲤鱼头、骨进行了脱脂处理,之后以水解度为测定指标,比较几种不同酶在不同条件下对鲤鱼头、骨的酶解效果,以期获得一种酶解效果较好的蛋白酶及其酶解的工艺条件,为下一步从酶解液中提取纯化生物活性肽奠定基础。

1 试验材料

1.1 材料

鲤鱼:购自山西农业大学菜市场。

1.2 化学试剂

胰蛋白酶(活力1∶250)、木瓜蛋白酶(活力1∶250)、中性蛋白酶(活力 1∶100),以上三种蛋白酶均购自天津诺奥酶制剂公司。

无水乙醚,异丙醇,乙醇硫酸钾、硫酸铜、浓硫酸、氢氧化钠、硼酸、盐酸(均为分析纯)

1.3 实验设备

YXQ-LS-30 S11立式高压灭菌锅:上海博迅实业有限公司医疗设备厂;FK-A型 组织捣碎机:江苏金坛市金城国盛仪器厂;HH系列恒温水浴锅:江苏金坛中大仪器厂;pHS-3C型pH计:上海精密科学仪器有限公司;80-2型号富华电动离心机:上海安亭科学仪器厂生产;BB 224S型分析天平:上海精天电子仪器有限公司;FD-1C型鼓风干燥机:北京博医实验仪器有限公司;UDK140凯氏定氮仪:意大利VELP公司;SXT-06索氏提取器;上海洪纪仪器设备有限公司。

2 试验方法

2.1 工艺流程

新鲜鲤鱼头、鱼骨→清洗→高压处理→匀浆→干燥→脱脂→酶解→灭酶→水解度测定。

2.1.1 鱼骨的前处理

原料用水清洗,放入容器中,在高压灭菌锅(0.18 Mpa)蒸煮30 min,取出后加入适量蒸馏水于高速组织捣碎机中匀浆,制成均匀糊状,转移至容器中后放置在40℃恒温水浴锅中待水分蒸发至原料呈粘稠状,再放置于鼓风干燥箱内60℃干燥,将干燥物取出捣碎至粉末状,放于冰箱冷藏以备后续脱脂酶解用。

2.1.2 脱脂

对每组试验均取2 g骨粉于烧杯中加入20 mL有机溶剂在恒温水浴锅内于一定温度下萃取一定时间,用移液枪移去上清液,保留沉淀,将沉淀置于通风处干燥,待沉淀干燥时,称重并分别用索氏提取器测剩余脂肪含量,计算脱脂率。

2.1.3 酶解

将干燥骨粉在最佳脱脂条件即异丙醇在30℃下萃取120 min进行脱脂,脱脂后的鱼骨粉在各酶最适酶解条件下(表1)加水酶解一定时间后于85℃下灭酶10 min,测定水解度。

表1 水解用酶的最适反应条件Table 1 The Optimum Reaction Condition of Hydrolysis Enzymes

2.2 试验方案

2.2.1 脱脂方式的筛选

以试剂种类、脱脂时间、脱脂温度为变量因素,进行3因素3水平的正交试验(表2),以脱脂率为指标,选取最佳脱脂用有机试剂并确定最佳的脱脂条件。

表2 脱脂方式筛选的因素水平表Table 2 The Factor Levels of Different Defatted Methods

2.2.2 最佳酶解条件的确定

本试验分别采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶对鲤鱼头及鱼骨进行酶解,每种酶分别在其最适温度和pH值下进行水解,以酶种类(E)、底物浓度(S)、酶用量(E/S)以及酶解时间(t)为变量因素,采用4因素3水平正交试验,以水解度为考察指标,选出水解鲤鱼骨蛋白的最佳酶解条件。因素水平编码表如表3所示。

表3 最佳酶解条件选取因表水平表Table 3 The Factor Levels of Design For Best Enzymatic Hydrolysis Methods

2.3 测定方法

2.3.1 脱脂率的测定——索氏提取法

以乙醚为溶剂,用索氏提取器在60℃下提取6～8 h。

脱脂率(%)=(样品总脂肪-样品脱脂后脂肪)/样品总脂肪 ×100%

2.3.2 蛋白质含量的测定——凯氏定氮法

2.3.3 水解度的测定——pH-stat法[8]

将酶解以后的骨粉溶液,用浓度为 0.01 mol◦L-1的氢氧化钠溶液调节溶液pH值至酶解时的最适pH,记录消耗氢氧化钠溶液的用量,带入公式计算水解度DH。

C、V——分别为水解过程中所加NaOH浓度(mol◦L-1)和体积(mL)

M——为原料中净蛋白质质量(g)

htot——为每一克原料中所含肽键的毫摩尔(mmol◦g-1)

a——为氨基的平均水解度

3 结果与分析

3.1 脱脂方式的确定

以脱脂率为指标,经过三因素三水平正交试验,测定结果如表4。

表4 脱脂方式筛选的直观分析结果表Table 4 The Resulte of Descriptive Analysis For Different Defatted Methods

采用有机溶剂进行脱脂,以脱脂率为指标,根据数据计算所得极差(R)值由大到小的顺序是:A＞B＞C,即试剂种类是影响脱脂率的最主要因素,其次为脱脂温度,再次为脱脂时间。根据K值分析各因素的最好水平选取为A3B1C1,即原料脱脂条件为:用异丙醇在30℃条件下萃取60 min脱脂。

这与试验所得A3B1C3即用异丙醇在30℃条件下萃取120 min脱脂效果最好不相符。做验证试验A3B1C1的脱脂率为85.5%低于试验A3B1C3所得的88.9%,因此可得脱脂最佳条件为A3B1C3:即异丙醇在30℃条件下萃取120 min。

3.2 酶解条件的确定

三种蛋白酶在不同的酶解条件下的水解度测定结果见表5。

表5 最佳酶解条件选取的直观分析表Table 5 The Resulte of Descriptive Analysis For Different Enzymatic Hydrolysis M ethods

根据数据计算所得极差(R)值由大到小的顺序是:A＞C＞D＞B,即酶种类是影响水解度的最显著因素,其次为酶用量,再次为酶解时间,最后为底物浓度。由K值分析可知,胰蛋白酶为水解最佳用酶,且按各因素最佳水平选取为A1B2C3D2。

这与试验所得A1B2C2D2最佳条件不符,做验证试验A1B2C3D2的水解度为19.20%高于A1B2C2D2所得的15.09%的水解度,因此可得最佳酶解条件为A1B2C3D2:即用胰蛋白酶在其最适酶解条件下以底物浓度1∶15,酶用量5400 U◦g-1,酶解4 h后水解度最高。

4 讨论

4.1 前处理

在前处理过程中,对原料进行了三种方式的预处理,即匀浆-高压,高压-匀浆和直接匀浆法。结果得出,高压-匀浆处理后的鱼头、鱼骨酶解物中蛋白质得率最高。鲤鱼头、骨酶解前进行高压处理的主要目的是将骨软化并对其进行杀菌。鱼骨中含有较多的油脂,经过高压处理可以去除部分油脂,这样为下一步的脱脂创造条件。另外从匀浆过程考虑,高压后的鱼头、骨更易于匀浆。因此,在后面的预处理中均采用先高压蒸煮再匀浆这种预处理方法。这与张建荣[9]对鲶鱼骨,贾冬英[10]对鲢鱼骨蛋白质酶解时所进行的预处理方式一致。

4.2 脱脂

通过预试验得知未经脱脂处理的鱼骨蛋白水解物为淡黄色,而脱脂后蛋白水解物呈乳白色,这是因为鱼下脚料中含有丰富的鱼油,在水解过程中鱼油极易氧化,影响到酶解液的感官品质和其他特性,所以必须对水解底物进行脱脂处理。另外,有研究表明脱脂后的水解度高于脱脂前的,这可能是因为蛋白质和水的相互作用受溶液中存在的其他成分影响,脱脂后的蛋白质不受脂肪的包裹而易被酶作用的缘故[11]。

无水乙醚、乙醇、异丙醇都是良好的有机溶剂及萃取剂。由表4可以看出,第七组的脱脂效果最好,脱脂率达88.9%,其脱脂条件为异丙醇30℃条件下脱脂120 min。第二组和第三组的脱脂率显著低于其他组,原因是无水乙醚的沸点为34.5℃,当脱脂温度高于其沸点时,无水乙醚自然挥发,达不到脱脂的目的。

脱脂方法除了用有机溶剂进行萃取脱脂外,还可用蒸煮法或用脂肪酶进行脱脂,这三种方法的脱脂效果比较还需进一步试验。

4.3 酶解

该试验作为课题“鲤鱼骨酶解工艺优化及活性物质的提取”的一部分,其最终目的是要从酶解液中得到具有生物活性的肽类物质。在酶法制备生物活性肽中酶的选择是关键,酶是具有生物活性的高效催化剂,其专一性强。针对底物,选用不同的酶,能获得不同比例的氨基酸、二肽及三肽,从而得到的酶解液也具有了不同的水解度以及不同的生物活性。目前应用于实际生产中的蛋白酶主要有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶。因此,本试验选取这三种蛋白酶对鲤鱼骨蛋白进行水解。

试验结果得出胰蛋白酶为本试验所选取的三种酶中水解度最高的酶,这与胰蛋白酶的酶切位点以及胰蛋白酶酶解产物的结构有关。胰蛋白酶是肽键内切酶,它能把多肽链中精氨酸或赖氨酸残基中的羧基侧切断,而在鲤鱼骨蛋白中精氨酸和赖氨酸含量丰富,所以胰蛋白酶为最佳用酶。但是由于鱼的品种不同,其营养成分的组成也不同,所以胰蛋白酶并不一定是水解所有鱼骨的最佳用酶,不同的鱼种可能有不同的最佳水解用酶,同时鲤鱼骨的酶解工艺不一定适合另一种鱼。因此确定每一种鱼的最佳水解用酶及最佳水解工艺条件仍然需要大量试验。

5 结论

本试验采用先高压后匀浆对鲤鱼头及鱼骨进行前处理,然后使用三种不同的有机溶剂(无水乙醚、异丙醇、乙醇)在不同的脱脂温度和脱脂时间下对鱼骨粉进行脱脂处理,从中筛选最佳的脱脂方式,接着采用三种不同的酶(胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶)在不同的条件下对脱脂以后的鱼骨粉进行酶解,从中筛选最佳酶解条件。通过本试验,我们主要得到以下结论:

(1)在鲤鱼骨有机溶剂萃取脱脂方面,通过三因素三水平的正交试验确定异丙醇的脱脂效果最好,且最佳的脱脂条件为异丙醇在30℃条件下脱脂120 min。

(2)通过四因素三水平的正交试验,以水解度为指标,确定胰蛋白酶为水解鲤鱼头及鱼骨的最佳用酶,且最佳酶解条件为:用胰蛋白酶在其最适酶解条件下以底物浓度为 1∶15,酶用量为 5400 U◦g-1,酶解4 h。

本试验结果为今后从鲤鱼头及鱼骨酶解液中提取活性肽的研究奠定了基础,也对骨蛋白活性肽在食品和药品中的应用起到一定的推动作用,具有较大的实践意义。

[1]Takeshi N,Nobutaka S.Isolation of collagen from fish wastematerial-skin,bone and fins[J].Food Chemistry,2000,68:277-281.

[2]Jeon You-jin,Byun Hee-guk,Kim Se-kwon.Improvement offunctional properties of cod frame protein hydrolysates using ultrafiltration membranes[J].Process Biochemistry,1999,35:471-478.

[3]Benjakul.Enzymatic Hydrolysis of Crayfish Processing By Products[J].Food Sci,1995,60(5):929-935.

[4]许庆陵,曾庆祝,崔铁军,等.鲢头酶解物对ACE的抑制活性[J].大连水产学院学报,2004,19(2):87-91.

[5]殷金莲,孙卉,谢顺虎,等.鲤鱼酶解液化技术研究[J].西北农林科技大学学报,2006(6):60-64.

[6]盘赛昆,顾小红,汤坚,等.鲤鱼肉酶解物清除羟自由基的研究[J].食品研究与开发,2009(9):23-27.

[7]徐怀德,殷金莲,孙卉,等,鲤鱼酶解发酵饮料的技术研究[J].农业工程学报,2006(11):257-260.

[8]袁斌,吕桂善,刘小玲.蛋白质水解度的简易测定方法[J].广西农业生物科学,2002,19(2):87-91.

[9]张建荣,马俪珍,甄润英,等.鲶鱼骨酶解产物抑菌活性的酶解工艺优化[J].食品科技,2008(8):173-176.

[10]贾冬英,赵宏铭,姚开,等.鲢鱼头及骨中蛋白质的酶解条件优化[J].食品科技,2007(4):243-246.

[11]M orimura S,Nagata H,Uemura Y.Development of an effective process for utilization of collagen from livestock and fish waste[J].Process Biochemistry,2002,37:1403-1412.