地木耳提取液及根瘤菌对小叶锦鸡儿幼苗生长的影响

刘晓云，郭振国，杨亚男，刘桂霞，王 娜，戴燕燕，王易鹏，郭小叶，魏 爽

(1.河北大学生命科学学院，河北省微生物多样性研究与应用重点实验室，河北 保定 071002；2.河北省保定市第三中学，河北 保定 071002； 3.西南林学院保护生物学院，云南 昆明 650224)

小叶锦鸡儿(Caraganamicrophylia)是豆科蝶形花亚科锦鸡儿属植物，别名小柠条、牛筋条，我国是主要分布地区，从东北的呼伦贝尔草原到西北的甘肃等地都有自然分布[1]。小叶锦鸡儿具有抗旱、耐寒、耐贫瘠的特点[2]，为固定、半固定沙地的优势种[3]；同时兼具有丰富的营养，是牲畜的良好饲料，它是集“生态效益、经济效益和社会效益”于一体的“三效合一”树种[4]。目前，小叶锦鸡儿在内蒙古科尔沁沙地[3]及内蒙古半干旱草原地区[5]、辽西地区[4]、河北宣化黄羊滩[6]等地得到应用，用于植被恢复、保育土壤、以及饲料防护林的培育工作。

地木耳(Nostoccommune)是一种地衣，俗称地软、地皮菜，是真菌和藻类的共生结合体，属自养植物，可进行光合作用，在我国各地均有广泛分布[7]。已有研究表明，地木耳提取液可有效提高小麦(Triticumaestivum)[8]、石竹(Dianthuschinensis)和孔雀草(Tagetespatula)[9]等种子的萌发及幼苗的生长；王静等[10-11]研究了地木耳对土壤含氮量的影响，并将其作为肥料分别施用于马铃薯(Solanumtuberosum)及番茄(Lycopersiconesculentum)，观察其营养生长及开花情况。结果表明，施用地木耳可增加土壤中的含氮量，并证实了它可以利用自身的碳源物质进行固氮作用，向周围环境泌氨，具有明显的增肥作用，现在国内已有地木耳的人工培育机构[12]。地木耳的这些优点可考虑应用在小叶锦鸡儿的生长调节上，国内尚无这方面的研究。由于小叶锦鸡儿是豆科植物，具有豆科植物共生固氮的特点，可以与根瘤菌形成根瘤，进行生物固氮以获取氮素营养，目前对小叶锦鸡儿根瘤菌的研究已有许多报道[13-15]。在菌剂应用方面，刘振龙和蔡安国[16]的研究表明小叶锦鸡儿接种根瘤菌后，能显著地提高植株幼苗的结瘤率，使其能更早地共生固氮，从而促进植物生长。

鉴于小叶锦鸡儿的栽培和经济价值以及根瘤菌菌剂与地木耳提取液对植物生长的调节作用，本研究将这2种微生物制剂应用在小叶锦鸡儿幼苗生长上，以研究其对该植物生长的促进作用，探讨其应用在小叶锦鸡儿种植和栽培上的可行性，为该植物应用在干旱草原和沙化土壤的植被恢复中提供生物肥料。

1 材料与方法

1.1试验材料 试验用地木耳以及小叶锦鸡儿根瘤菌、小叶锦鸡儿种子，均由河北大学河北省微生物多样性研究与应用重点实验室提供。

1.1.1地木耳提取液的制备 新鲜地木耳(2010年5月采集于河北张家口沽源牧场)用水洗净后，60℃烘干、粉碎，准确称取0.1 g加入到1 L水中，用NaOH调节其pH值为10.0；80℃水解4 h，过滤取上清液，将滤渣重复水解一次，取上清液；将两次上清液浓缩至100 mL，即得原液；用蒸馏水依次稀释得到1/10原液、1/20原液、1/50原液。

1.1.2根瘤菌菌剂的制备 将小叶锦鸡儿根瘤菌菌株HBU037001、HBU037002、HBU037003分别在YMA平板上活化后保存至斜面，然后接种于盛有100 mL YMA液体培养液的250 mL三角瓶中，于28℃恒温摇床，转速150 r/min培养48 h即得根瘤菌液体菌剂。

1.2试验方法

1.2.1盆栽试验 精选饱满的小叶锦鸡儿种子，95%乙醇浸泡3 min，0.1%氯化汞表面消毒5 min，用无菌水将消毒后的种子洗涤3～5遍。

分别用地木耳提取液原液、1/10原液、1/20原液、1/50原液4种剂量的地木耳提取液分别浸种6 h，并用蒸馏水进行相同处理作为对照组。

将种子播入花盆中，每盆播20粒种子，覆土1～2 cm，每种处理设置3个重复，共15盆，每天定时统计当天出苗数量；当种子不再萌发时，每盆保留5株长势较好且一致的幼苗，每2 d分别用等量的不同剂量地木耳提取液喷施幼苗，用蒸馏水喷洒对照组植物。生长20 d后进行指标测定，测定株高(从子叶痕处至离生长点最近的展开叶顶端，每盆测量5株)、地上生物量(以第1片子叶叶痕处作为划分标准，植物样品先在烘箱中120℃杀青40 min，后于60℃烘干至质量恒定，每盆测量5株)、叶面积(将植株的叶片全部剪下，放在坐标纸上，统计叶片所占的格数，然后得出每株植物叶面积总数值，每盆测量5株)。

1.2.2田间试验 选择地木耳提取液原液的1/10、1/20和1/50共3个剂量处理，3个不同的根瘤菌菌剂处理及地木耳提取液和根瘤菌菌剂联合处理9个组合，共15种处理；采用完全随机区组设计样方，每个样方2 m×2 m，另设不进行地木耳和根瘤菌菌剂处理的空白对照，每个处理3个重复。

每个处理的播种量为55 g，约为1 200粒种子；将小叶锦鸡儿的种子用地木耳提取液或根瘤菌菌剂分别浸泡6 h，播种时，用干燥的土壤将种子拌匀；地木耳和根瘤菌菌剂联合处理时，先将小叶锦鸡儿的种子用地木耳提取液浸泡6 h，再用菌剂处理2 h；每天定时统计当天出苗数量，每3 d分别用等量的不同浓度地木耳提取液喷施幼苗，其他处理及对照用蒸馏水喷洒叶面，50 d后观察生长情况，指标测定方法同室内盆栽试验，每个重复测定10株植物。

1.2.3数据分析 通过SPSS 13.0数学统计分析软件对实验数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)；在满足方差齐性的情况下，再利用Duncan检验进行多重比较，确定各因子内部不同水平平均值之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1盆栽试验 对盆栽生长20 d的小叶锦鸡儿的种子出苗率、株高、干质量和叶面积进行了测定，统计结果见表1。

试验结果表明，地木耳提取液对小叶锦鸡儿的出苗率、株高和生物量均有显著影响(P<0.01)。地木耳提取液原液对小叶锦鸡儿的出苗率有明显的抑制作用，1/20和1/50的稀释液对出苗率的影响较对照和其他处理差异显著(P<0.01)，1/20稀释液的效果最好，出苗率可达48.3%；处理后获得的植株株高与对照相比均具有显著差异(P<0.01)，而各个处理之间的株高值无显著差异(P>0.01)。

从生物量来看，各个处理与对照相比差异显著，相比对照提高7.8%～21.9%，其中1/20的稀释液提高幅度最大，与其他处理之间差异显著(P<0.01)；比较其对叶面积的影响，1/20稀释液与其他处理均差异显著(P<0.01)，叶面积数值最高。

表1 盆栽试验地木耳提取液对小叶锦鸡儿出苗及生长的影响

2.2田间试验 由盆栽试验结果发现，地木耳原液对种子的萌发起抑制作用，因此田间试验选取了1/10、1/20和1/50的地木耳稀释液；选择根瘤菌菌株HBU037001、HBU037002和HBU037003制作菌剂；种子经过表面处理后播种，2 d后开始出苗，植物生长到50 d开始测量植株高度、叶面积、生物量等指标。

统计分析表明，地木耳提取液和根瘤菌菌剂对小叶锦鸡儿的出苗率、株高、生物量和叶面积均有显著影响(P<0.01)。

表2 田间试验地木耳提取液及根瘤菌菌剂对小叶锦鸡儿出苗及生长的影响

根瘤菌菌剂HBU037001和HBU037002对种子的出苗率影响较其他处理显著，菌剂HBU037001处理种子出苗率最高，在90%以上；地木耳提取液中，1/20稀释处理出苗率较好，达到73.8%，其他各处理也均比对照有所提高。比较3种不同的处理方式，1/50地木耳提取液、根瘤菌菌剂HBU037001以及联合处理1/10地木耳提取液与菌剂HBU037001等较对照相比，株高差异显著(P<0.01)，其中根瘤菌菌剂HBU037001处理的植物株高最高。

从生物量来看，1/20地木耳提取液、菌剂HBU037002等对小叶锦鸡儿的生物量较对照具有显著的差异，较对照分别提高11.5%和17.7%；综合来看，地木耳提取液1/10与菌剂HBU037001的联合处理又较其他处理差异显著，生物量提高达到28.2%。在叶面积的测定中，1/20、1/10稀释的地木耳提取液、菌剂HBU037002以及联合处理1/10地木耳提取液+菌剂HBU037001等较对照具有显著差异，其中1/20稀释的地木耳提取液效果最好，相比对照提高42.8%。

3 讨论

本研究结果显示，不同的根瘤菌菌株对于植物的生长影响差异较大。在3个供试菌株中，菌株HBU037001处理的种子出苗率最高，而菌株HBU037002提高幼苗的干质量幅度最大。已有研究[17]表明，根瘤菌的施用可以提高植物种子的萌发率，这对于植物在干旱环境中定植非常重要。因此，小叶锦鸡儿的种植需要接种根瘤菌菌剂以提高其对干旱的抗性。因此，在今后的研究中，应多筛选不同的根瘤菌菌株进行研究，将不同菌株的优点结合起来，对其特性研究，以选择表现最优的根瘤菌菌株制作菌剂，在生产上进行应用。

地木耳提取液处理对植物的干质量影响较显著，但根瘤菌菌剂与地木耳提取液的联合处理(地木耳提取液1/10原液+菌剂HBU037001)为所有处理中提高植物干质量最高者，这可能与两者对植物生长调节的累加作用有关。地木耳叶面喷施可以使营养物质从叶面输送，促进植物快速吸收地木耳提取液中的营养物质，而根瘤菌与植物形成的根瘤能利用空气中的游离氮合成氨，促进植物根际发育，使生物量增加。根据盛家荣等[18-19]的研究结果，地木耳提取物中起促进植物生长作用的物质主要是多糖，而在根瘤菌与豆科植物的识别机制当中，根瘤菌表面多糖是植物与根瘤菌互作的必需物质[20]，所以地木耳也间接地影响着根瘤菌的活动；此外根瘤菌除了固氮活性外还可以活化土壤中的微生物群落，为植物提供磷、钾等其他营养及多种微量元素[21-23]，并可有效影响土壤呼吸速率[24]。

本研究证实这两种微生物制剂对小叶锦鸡儿的种植具有应用价值，这两种微生物制剂成本低，制作简易、无污染，是制作生物肥料的理想材料。今后将进一步筛选更多的高效固氮根瘤菌菌株，并选择人工培育的地木耳作为材料进行研究，从而对这两种微生物制剂进行研究和开发，减少化肥使用并节约国家资源[25]，为我国"退耕还林"、贫瘠土壤植树造林、以及在干旱草原和荒漠草原植被恢复服务。

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