小花碱茅HKT1;4基因片段的克隆与序列分析

李 剑,赵常玉,吴永娜,包爱科，马 清,郭 强,王锁民,张金林

(兰州大学草地农业科技学院 农业部草地农业生态系统学重点开放实验室,甘肃 兰州 730020)

大多数农作物不能在高盐环境下生长，灌溉地盐渍化对农业生产力造成了严重威胁[1-2]。盐渍化土壤中，Na+是一种毒害离子，它可以抑制K+的吸收，降低酶活性，影响植物新陈代谢，最终表现为植株生长缓慢甚至死亡[3-4]。K+是植物生长发育所必需的矿质元素之一，也是植物细胞中最丰富的一价阳离子，占植物干质量的2%～10%，它参与调节细胞膨压、电荷平衡、气孔开闭和酶活性等许多重要的生理生化过程[5-6]。在盐胁迫下，限制Na+吸收，增加Na+外排，同时提高对K+的选择性吸收能力，维持细胞中高的K+/Na+是植物抗盐性的关键[7]。大量研究发现，高亲和性K+转运蛋白(high-affinity K+transporter，HKT)在高等植物拒Na+和选择性吸收K+过程中发挥着重要作用[8-9]。Schachtman和Schroeder[10]首次从小麦(Triticumaestivum)幼根中克隆到TaHKT2;1，随后相继在其他植物中也发现了HKT类蛋白。根据异源表达差异，Platten等[11]将HKT类蛋白分为两类：第1类以拟南芥(Arabidopsisthaliana)AtHKT1;1为代表，主要转运Na+，在Na+回收中发挥作用，包括水稻(Oryzasativa)OsHKT1;5、一粒小麦(T.monococcum)TmHKT1;4-A2、TmHKT1;5-A1和小麦TaHKT1;5-D1；第2类以小麦TaHKT2;1为代表，为K+和Na+的共转运体，在K+、Na+选择性吸收中发挥重要作用，包括水稻OsHKT2;1和OsHKT2;2等。

小花碱茅(Puccinelliatenuiflora)广泛分布于我国东北和西北地区，是禾本科碱茅属多年生优质牧草，耐盐碱[12-13]。近年来，小花碱茅极强的抗盐碱性引起人们的广泛关注。阎秀峰等[14]通过洗叶技术，认为小花碱茅的耐盐机制是其具有泌盐能力。韦存虚等[15]采用扫描电镜和X射线电子探针研究发现蜡质层泌盐可能是其正常功能。但解剖学和叶表面观察都没有发现盐腺或泌盐结构[16-18]。研究表明，小花碱茅根部对K+/Na+选择吸收能力很强，约是小麦的2倍[19]；最新研究表明，叶片泌盐并不是小花碱茅耐盐的主要机制；限制Na+单向内流速率，减少体内Na+净积累，维持高的K+/Na+则是小花碱茅抗盐的关键[20]。本研究在已经克隆小花碱茅Actin[12]和AKT1[13]的基础上，进一步克隆其HKT1;4基因片段，旨为进一步探明小花碱茅拒Na+的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料 小花碱茅种子2010年采自甘肃省张掖市临泽县白寨村。EscherichiacoliDH5a菌株由农业部草地农业生态系统学重点开放实验室保存。

1.2主要试剂 植物总RNA提取试剂盒(生工生物工程上海有限公司生产)，反转录试剂盒(宝生物工程大连有限公司生产)，PCR扩增试剂盒、PCR产物回收试剂盒、pMD19-T Simple载体(宝生物工程大连有限公司生产)，DNA ladder(天根生化科技北京有限公司生产)，其他生化试剂均为进口或国产分析纯。

1.3试验方法

1.3.1总RNA的提取 从小花碱茅幼根(K+饥饿处理24 h)中提取总RNA，方法参考总RNA提取试剂盒说明书。

1.3.2引物的设计与合成 通过对高粱(Sorghumbicolor)、水稻和一粒小麦等几种植物HKT1;4基因的氨基酸序列进行同源性比对，找出高度保守的片段，对应于核苷酸片段，根据引物设计原则，利用DNAMAN和Primer Premier 5.0生物软件设计一对简并引物PF和PR，推测目的片段长度为635 bp。引物由上海生工合成。PF：5′-TCGYCTACTTCSTCRCCRTCTCCT-3′，PR：5′-CATGWACCCGCAGYTSGAGAACGT-3′，其中，Y=C/T，S=C/G，R=A/G，W=A/T。

1.3.3RT-PCR扩增 反转录过程按照试剂盒操作说明进行。PCR反应体系：10×PCR Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL、10 μmol/L PF 1 μL、PR 1 μL，Taq DNA polymerase(5 U/μL) 0.5 μL，cDNA 2 μL，加无菌水至总体积50 μL。反应程序：94 ℃热启动2 min；94 ℃变性30 s、58 ℃退火45 s、72 ℃延伸50 s，30个循环；最后72 ℃延伸7 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，按照胶回收试剂盒说明书回收和纯化目的片段，保存于-20 ℃备用。

1.3.4阳性克隆的筛选与鉴定 将回收目的片段与pMD19-T Simple载体按照物质的量10∶1混合，于16 ℃连接2 h。连接产物全部加入到100 μL感受态大肠杆菌细胞中，冰浴30 min；42 ℃热激90 s；冰浴1 min。加入800 μL无氨苄青霉素的液体LB培养基，摇菌1 h(37 ℃，180 r/min)。将菌液加入含有氨苄、x-gal和IPTG的LB固体培养基上，37 ℃过夜培养。次日，挑选白色单菌落，经PCR检测后送生工生物工程上海有限公司测序。

1.3.5序列的生物信息学分析 BLAST在NCBI网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行；序列的翻译和分析比较通过DNAMAN和Primer Premier 5.0生物软件进行。

2 结果

2.1总RNA的提取与检测 以小花碱茅幼根为材料提取总RNA，甲醛变性胶电泳和NANODROP1000核酸蛋白检测仪检测表明，提取的总RNA完全满足下一步试验需要。

2.2RT-PCR扩增 以总RNA反转录得到的cDNA为模板，用简并引物PF和PR进行PCR扩增。PCR产物经凝胶电泳检测后发现在比600 bp略高处有一条带，且上下无杂带，与预测的目的片段大小基本一致(图1)，推测可能是HKT1;4基因片段，有待进一步检测。

图1 PCR产物凝胶电泳图

2.3阳性克隆的鉴定 将目的片段连接到pMD19-T Simple载体上，转化E.coliDH5a。从LB培养基平板上随机挑选5个白色单菌落，分别摇菌后提取质粒，进行PCR检测，得到的扩增片段大小与所克隆片段一致(图2)，表明这些为阳性克隆，可以进行测序。

图2 阳性克隆的PCR检测

2.4测序结果与序列分析 阳性克隆测序结果表明，本试验得到一段长629 bp的HKT1;4序列片段，与GenBank中注册的高等植物HKT1;4基因核苷酸序列同源性在74%以上；编码209个氨基酸(图3)，将此氨基酸片段与其他植物HKT1;4蛋白氨基酸进行同源性比对后发现，与一粒小麦TmHKT1;4-A2、TmHKT1;4-A1、高粱(Sorghumvulgare)SbHKT1;4和水稻OsHKT1;4的同源性分别为73%、70%、67%和61%，从而确定本试验克隆的片段为小花碱茅HKT1;4基因，并命名为PutHKT1;4(图4)。采用在线TMpred Server软件(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html) 对小花碱茅PutHKT1;4氨基酸序列进行跨膜区预测发现可能存在5个跨膜区，序列位置分别为1-17，32-51，61-82，154-171，193-209(图3、图5)。多重比对后发现，小花碱茅PutHKT1;4氨基酸序列上存在编码P-loop A区域的一段保守序列IDLFFTAVSSMS，箭头所指的S为P-loop A区域的特异性丝氨酸离子选择性位点(图6)。

图3 小花碱茅PutHKT1;4基因片段核苷酸及推测的氨基酸序列

图4 PutHKT1;4与其他植物HKT1;4氨基酸序列的系统进化树

图5 PutHKT1;4氨基酸片段的跨膜区预测

3 讨论与结论

土壤中过多的Na+对植物是有害的，尤其是对盐比较敏感的农作物。研究Na+在植物体内的再循环途径，对于提高植物抗盐性意义重大。水稻OsHKT1;5的作用是从木质部中回收Na+，参与Na+在植物体中的再循环，从而减少Na+在植株地上部的积累[8]。 James等[21]从硬粒小麦(T.turgidum)耐盐品系149中分离到两个排Na+的主效基因Nax1和Nax2，拥有任意一个基因的品系植株比其他品系有更低的从根部向地上部转运Na+的比率，同时增加吸收K+的比率。Nax1位点能够从叶鞘和根木质部卸载Na+，防止Na+在地上部的过多积累，而Nax2位点只能在根部发挥作用。后来研究表明，一粒小麦TmHKT1;4-A2可能是Nax1的候选基因，TmHKT1;5-A1可能是Nax2的候选基因[22-23]。本研究所克隆的PutHKT1;4基因和一粒小麦TmHKT1;4基因一样，属于HKT家族的第1类。通常第1类HKT在第1个P-loop区域都有一个丝氨酸离子选择性位点，第2类为甘氨酸离子选择性位点(个别除外，如水稻OsHKT2;1)，这些位点可能与K+、Na+选择性吸收相关[11]，本试验克隆到的小花碱茅PutHKT1;4也有一段12个氨基酸的保守P-loop区域，且有丝氨酸位点。小花碱茅蕴藏着丰富的抗盐基因资源，PutHKT1;4基因片度的克隆将为进一步研究小花碱茅耐盐的分子机制奠定了基础。

图6 PutHKT1;4氨基酸序列与其他植物HKT1;4氨基酸序列多重比对图

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