大鼠恐惧应激模型的建立及指标筛选

刘佳佳，潘 霄，严 进，唐云翔

多种形式的应激刺激可引起动物行为、认知以及机体多项功能障碍，已引起许多学者的关注。恐惧应激动物模型是模拟人类情感的一种情绪应激模型，主要是通过给予实验动物恐惧的创伤应激，测试实验动物的行为和生理变化。多项研究表明恐惧应激可以直接引起实验动物的一系列的防御性行为反应，包括呆立反应、心率增快、惊跳反应、逃避反应等[1]应激反应，从而引起神经系统、心血管系统、免疫系统、内分泌系统等微环境的变化[2]。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 64只健康雄性Wisatr大鼠，体重（200±20）g，购自第二军医大学实验动物中心。于安静环境下饲养，自由摄食饮水，自然光照，温度22～26℃。将实验动物随机分为恐惧模型组和对照组，每组32只。

1.2 恐惧模型制作方法

1.2.1 恐惧模型组 大鼠群居饲养于不锈钢笼中（50 cm×30 cm×20 cm），自由摄食饮水，饲养10 d。第11天放入声电刺激仪（40 cm×30 cm×20 cm，购自上海软隆科技发展有限公司）。刺激仪四周为黑色玻璃，底部铺设铜栅，可以通1 mA交流电，顶部设有摄像器及发声器，噪音音量分贝固定。前5 min为适应期，之后给予2 s（75 Db∶1000 Hz）噪音，并紧跟1 s电流刺激（1 mA），间隔1 min，共30次。第12、13天重复实验。第14天实验只给予噪音5 min，不予电击，摄像记录第6～30 min内大鼠行为变化。实验结束立即放入自发活动箱内，进行应激后行为学检测。自第15天起每天于固定时间重复第11天实验。

1.2.2 对照组 大鼠于同样环境下饲养10 d，第11天放入声电刺激仪内，前5 min为适应期，之后只给予2 s（75 Db∶1000 Hz）噪音，无电击。 第12、13天重复实验。第14天摄像记录5 min噪音后6～30 min内大鼠行为变化。实验结束放入自发活动箱，进行应激后行为学检测。自第15天起每天于固定时间重复第11天实验。实验中抓取动物动作轻柔，避免不必要的刺激干扰实验结果。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 冻结时间 冻结姿势 （freezing posture）：静止、呆滞、蜷缩、蹲伏等，期间仅有呼吸和轻微摇摆运动。其总时间称为冻结时间（freezing time），即大鼠行为得分。行为评定采用盲法，单位以秒来计算，由3名观察者观看录像后评分，取其平均值。

1.3.2 体重 自造模成功之后第2天算起分别于1、2、3、4周每周周中 （实验第18、25、32、39天），对两组大鼠体重进行测量，观察恐惧应激对大鼠体重的影响。YP系列电子天平（精度0.1 g）购自上海精密科学仪器有限公司。

1.3.3 自发活动 自造模成功之后第2天算起分别于1、2、3、4周每周周中 （实验第 18、25、32、39天），进行两组大鼠自发活动实验。测试大鼠5 min内在新异环境的活动情况。自发活动视频分析系统（DigBehv-LR）购自上海吉量软件科技有限公司。

1.3.4 血清皮质酮含量测定 自造模成功之后第2天算起分别于1、2、3、4周每周周中（实验第18、25、32、39天），对实验大鼠进行断头取血，全血37℃恒温静置30 min后，3 900 r/min离心10 min，取上层血清，送检。血清皮质醇（COP）放射免疫试剂盒购自上海西塘生物科技有限公司并有该公司代测，检测过程符合各项规范。

1.3.5 血清C反应蛋白含量测定 自造模成功之后第2天算起分别于1、2、3、4周每周周中（实验第18、25、32、39天），对实验大鼠进行断头取血，全血37℃恒温静置30 min后，3 900 r/min离心10 min，取上层血清，送检。血清高敏C反应蛋白（hs-CRP）放射免疫试剂盒购自上海西塘生物科技有限公司并有该公司代测，检测过程复合各项规范。

1.4 统计学处理 所有数据均采用SPSS17.0软件进行处理。用均数±标准差（±s）表示，计量资料采用独立样本t检验；同一对象不同时点的计量资料采用重复测量的方差分析。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 冻结时间 恐惧模型组大鼠在第11天实验噪音后出现冻结姿势：静止、呆滞、蜷缩、蹲伏等，期间仅有呼吸和轻微摇摆运动并伴有立毛、肌肉轻微振颇、大小便失禁等表现。行为评定采用盲法，冻结时间即为大鼠得分，单位以秒来计算，由3名观察者观看录像后评分，取其平均值。三者评定一致性Kappa值>0.95。两组间行为学得分存在显著性差异，恐惧模型组大鼠行为学得分高于对照组 （t=5.700，P<0.01），见图1。

图1 二组行为计分

2.2 体重 随着饲养时间的增加两组大鼠体重均有所增长，但恐惧模型组体重增加较缓。第1周两组大鼠体重无显著差异，第2、3周恐惧模型组体重低于空白对照组（P<0.05），第4周恐惧模型组体重显著低于对照组（P<0.01），见表1。

表1 两组大鼠体重（±s，g）

表1 两组大鼠体重（±s，g）

两组比较，*P＜0.05，#P＜0.01

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2.3 自发活动

2.3.1 休息时间 第1、3、4周，恐惧模型组休息时间显著高于对照组（P<0.05），第2周恐惧模型组休息时间非常显著高于对照组（P<0.01），见表2。

2.3.2 活动次数 第1、4周，恐惧模型组活动次数显著少于对照组（P＜0.05）。第2、3周恐惧模型组活动次数非常显著少于对照组（P＜0.01），见表3。

表2 两组大鼠自发活动时休息时间（±s，s）

表2 两组大鼠自发活动时休息时间（±s，s）

两组比较，*P＜0.05，#P＜0.01

?

表3 两组大鼠自发活动次数（±s，次）

表3 两组大鼠自发活动次数（±s，次）

两组比较，*P＜0.05，#P＜0.01

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2.4 皮质酮含量 第1、3、4周恐惧模型组血清皮质酮高于对照组（P<0.05），第2周恐惧模型组血清皮质酮显著高于对照组（P<0.01），见表4。

表4 两组大鼠血清皮质酮水平（±s，μmol/L）

表4 两组大鼠血清皮质酮水平（±s，μmol/L）

两组比较，*P＜0.05；，#P＜0.01

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2.5 血清C反应蛋白含量 第1周恐惧模型组血清hs-CRP浓度显著高于对照组（P<0.05），第2、3、4周恐惧模型组hs-CRP浓度非常显著高于对照组（P<0.01），见表5。

表5 两组大鼠血清C反应蛋白水平（±s，μmol/L）

表5 两组大鼠血清C反应蛋白水平（±s，μmol/L）

两组比较，*P＜0.05，#P＜0.01

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3 讨 论

诸多研究表明多种应激都可以使动物产生行为和情绪障碍[3]。恐惧应激模型是根据经典条件反射制造的一种模拟恐惧情感的动物模型。恐惧条件反射是指在一种明确的中性刺激（一般是光照或声音）与一种恶性刺激（通常是电击足底）之问建立联系，这种联系建立与否可以用木僵行为实验进行检测[4]。目前条件性恐惧训练已经成为一种经典的诱导焦虑恐惧反应模型的方法，被国外学者所采用。

本实验通过改良的Takeuchi方法，发现条件恐惧应激模型实验组出现的不同行为学变化，在噪声后出现冻结姿势：静止、呆滞、蜷缩、蹲伏等，期间仅有呼吸和轻微摇摆运动，这些行为变化与文献报道一致[5]。以上所述行为的总时间称为冻结时间，即条件恐惧模型组大鼠得分。本研究发现在连续3 d噪音+电击刺激后恐惧模型组大鼠在第14天冻结时间显著高于对照组，证明造模成功。

情绪变化会对体重产生影响，多项研究表明恐惧、抑郁、焦虑等情绪症状会引起厌食或贪食等饮食方面发生变化，最终引起体重的变化[6]。本研究发现随着饲养时间的延长，两组大鼠体重均呈生长状态，但与对照组比较恐惧模型组体重增长缓慢，提示恐惧应激对大鼠体重增长有一定影响。

自发活动实验可用来测试动物的活动性和对新异环境的适应能力[7]，一些研究已从分子水平探讨应激对大鼠行为的影响机制[8]。本实验通过对大鼠自发活动实验的研究，发现恐惧模型组与对照组差异显著。在第2周恐惧模型组休息时间显著长于对照组，而活动次数显著低于对照组，第1、3、4周统计学差异小于第2周。表明恐惧应激在第2周处于高峰期。

近几年的研究已经证明，下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴在机体的应激反应中发挥着重要作用，应激能够激活 HPA轴和交感神经系统，导致肾上腺皮质释放糖皮质激素以及交感神经末梢和肾上腺髓质释放儿茶酚胺增加[9]。本研究发现第2周血清皮质酮含量处于最高峰，第3、4周有下降趋势，表明较长时间恐惧应激对大鼠血清皮质酮含量影响不同与短期应激的变化趋势，这与一些研究结果相符[10、11]。提示噪音加电击已不能对大鼠造成新意额外刺激。

hs-CRP是一项敏感的炎症反应指标，心理应激能使炎症和抗炎症细胞因子之问的平衡破坏，造成免疫功能紊乱[12]。本研究显示，随着恐惧应激时间的增长，大鼠血清hs-CRP持续升高，表明恐惧应激对大鼠机体功能造成持续损伤。但本研究未从分子水平进一步提示氧化应激与炎症之间的关系，尚待以后进一步研究证实。

本研究建立了较为可信的大鼠条件恐惧应激模型，并得出了恐惧应激对大鼠一般行为及机体损伤指标的损伤效应，以期为抗恐惧应激药物评价提供可靠的依据。

[1]Conrad CD，Mauldin Jourdain ML，Hobbs RJ.Metyrapone reveals that previous phronic stress differentially impairs hippoeampal dependent memory[J].Stress，2001，4(4)：305-318.

[2]安献丽，郑希耕.创伤后应激障碍的动物模型及其神经生物学机制[J].心理科学进展，2008，16(3)：371-377.

[3]Rosch PJ.Stress and memory loss：some speculations and solutions[J].Stress Med，1997，13：1-6.

[4]Davis M.Are different parts of the extended amygdala involved in fear versus anxiety?[J].Biol Psychiatry，1998，44(12)：1239-1247.

[5]Takeuehi T，Iwanaga M，Harada E.Possible regulatory mechanism of DHA-induced anti-stress reaction in rats[J].Brain Res，2003，964(1)：136-143.

[6]陈纯姿，刘少文，赵巍峰.慢性应激对大鼠行为和体重的影响[J].中国民康医学杂志，2005，17(3):129-130.

[7]Keeney AJ，Hogg S.Behavioural consequences of repeated social defeat in the mouse：preliminary evaluation of a potential animal model of depression.Behav Phammvol，1999，10(8)：753-764.

[8]严 进，王春安，叶阿莉，等.应激对大鼠行为和部分脑区谷氨酸含量的影响[J].心理学报，1995，27（4）：422-426.

[9]Li ZH,Sun L,Zhang HY,et al.Elevated homcysteine was associated with hemorrhagic and ischemic stroke,but methylennetetrahydrofolate reductase gene C677T polymorphism was a risk factor for thrombotic stroke[J].Stroke,2003,34:2085.

[10]严 进，王春安，陈宜张，等.心理性应激引起的大鼠行为、血浆皮质酮及脑区氨基酸水平的变化[J].第二军医大学学报，1997，18（4）：330-333.

[11]刘继民.长期心理应激对大鼠血浆皮质酮、儿茶酚胺水平及免疫功能的影响[J].青岛大学医学院学报，2005，41（3）：228-228.

[12]Maes M.Major depression and activation of the inflammatory response system[J].Cytokines,Stress,and Depression,1999，（1）:25-46.