多因子诱导的杀伤细胞联合白介素－2胸腔内注射治疗癌性胸腔积液的临床疗效观察

王 娟，陶贞霞，刘荣英，曹艳丽，国 虹，蔡秀萍，许卫星，王建华，吴秀然，李海玲

原发及转移的肺部、胸膜肿瘤均可引起癌性胸腔积液。目前癌性胸腔积液多采用化疗药物胸腔内注射治疗，部分应用免疫增强剂如香菇多糖、白介素－2等胸腔内注射治疗［1－2］，但采用以上方法治疗多维持时间短，且对全身肿瘤无治疗作用。我科采用多因子诱导的杀伤 (CIK)细胞培养后全身应用配合CIK细胞联合白介素－2胸腔内注射治疗癌性胸腔积液，取得了良好的治疗效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2008年6月—2010年12月我科收治的癌性胸腔积液患者15例，其中原发肺癌4例，乳腺癌肺转移3例，弥漫性大B细胞淋巴瘤 (DLBCL)肺转移3例，肾癌肺转移3例，急性白血病2例，原发病均经手术切除后病理证实(急性白血病除外)。其中急性白血病、乳腺癌肺转移、弥漫性大B细胞淋巴瘤及3例肺癌患者均应用常规化放疗全身治疗后效果不佳，1例原发肺癌患者拒绝再次应用化疗，肾癌患者为手术后1.5～2.0年，未接受其他治疗。

1.2 细胞培养过程 应用血细胞分离机(COBE，美国)分离患者外周血单个核细胞约3×109个，在百级无菌层流病房超净工作台上经去浆、Ficoll淋巴细胞分离液 (密度1.077 g/ml购于天津灏洋生物有限公司)分离单个核细胞，并应用RPMI－1640细胞培养液 (购于美国Gibco公司)洗涤2次 (1 500 r/min离心，15 min/次)后，加入细胞培养瓶中 (购于美国 Costar公司)，放入37℃、5%CO2孵育箱中 (MCO－15AC日本三洋公司)，2 h后将悬浮细胞移入另外培养瓶中，调整细胞浓度为2×106/ml，加入CD3单抗 (武汉生物制品研究所)，γ－干扰素2 000 U/Ml(购于上海克隆生物高技术有限公司)，计为D0天，D1天加入白介素－2 1 000 U/ml(购于北京双鹭药业有限公司)诱导CIK细胞，每隔2～3 d换液1次，加入同量γ－干扰素、白介素－2，同时抽取离心后的上清液行细菌、真菌培养，放至37℃、5%CO2孵育箱中继续培养。

1.3 培养产品的回输及鉴定

1.3.1 培养产品的回输 在CIK细胞培养的 D11、D13、D15天，如细菌、霉菌培养阴性，活细胞＞95%，分次给患者回输。将培养瓶内的细胞悬液分装入50 ml离心管中，1 500 r/min离心15min，去上清，加入含20 g/L人血清蛋白 (上海莱氏血液制品公司)的0.9%氯化钠溶液洗涤2次，将最后得到的细胞悬液留取(0.5～1.0) ×109联合白介素－2胸腔内注射外，将剩余细胞悬浮于250 ml含20 g/L人血清蛋白及白介素－2 2×105U的0.9%氯化钠溶液中，回输细胞数为 (1～3) ×109/次，通过输血器经静脉输注，输注前予10%葡萄糖酸钙、苯海拉明防治过敏反应，记录每次输注CIK细胞后有无寒战、发热、过敏及心肺功能变化。细胞培养过程中及细胞输注后患者应用白介素－2 200万U肌注，隔日1次，α－2b干扰素300万U肌注，隔日1次，总疗程为40 d。

1.3.2 培养产品的检定 细胞培养D0、D11、D13、D15天，经流式细胞仪 (FACS C

alibur美国BD公司)进行免疫表型测定，抽取培养物1 ml加入EDTA抗凝管，充分混匀，取50μl入流式细胞仪试管1～3，分别加入20μl鼠抗 IgG1－FITC/IgG2－PE/CD45－PerCP、CD3－FITC/－PE/CD45－PerCP、CD4－FITC/CD8－PE/CD45－PerCP(试剂购自美国BD公司)，涡旋器充分混匀，避光孵育20～40 min，离心，磷酸盐缓冲液 (PBS)洗涤，过滤后，加入PBS 300μl上流式细胞仪检测。所用流式细胞仪FACSCalibur，数据获取采用Cell Quest3.2，所用蒸馏水、PBS、红细胞裂解液均经过0.2μm过滤网过滤，应用鼠抗人IgG1－FITC/IgG2－PE/CD45－PerCP为对照设置样本非特异荧光，即阴性对照，应用淋巴细胞群的anti－CD4－FITC/CD8－PE/CD45－PerCP调节各荧光的补偿值，然后进行细胞的测定及分析。

1.3.3 胸腔内注射 胸腔积液经B超定位后，尽量将胸腔积液抽净后，注入CIK细胞 (0.5～1.5) ×109加入白介素 －2 100万U，隔日1次，每疗程3次。

1.3.4 T细胞亚群检测 细胞免疫治疗前后抽取患者静脉血1 ml加入EDTA抗凝管，充分混匀，取50μl入流式细胞仪试管1～5，分别加入20μl鼠抗 IgG1－FITC/IgG2a－PE、CD3－FITC/－PE、CD3－FITC/CD4－PE、CD3－FITC/CD8－PE、CD3－FITC/CD16－PE+(试剂购自美国BD公司)，涡旋器充分混匀，避光孵育20～40 min，离心，PBS洗涤，过滤后，加入PBS 300μl上流式细胞仪检测。采用T细胞亚群自动分析软件。

2 结果

2.1 不良反应 除11例患者有轻微发热(体温最高37.6℃，未用特殊处理自行降至正常)外，其他4例患者静脉输注过程顺利无反应，15例患者第1次胸腔注射后均有局部疼痛、胸腔内烧灼感，第2次注射后症状减轻，所有患者均能很好地耐受该项治疗。

2.2 CIK细胞培养过程中表型的变化经流式细胞仪分析表明，CIK细胞属于异质细胞群，随着培养时间的延长，CIK细胞中、双阳性细胞的百分含量大幅度上升 (见表1)。

2.3 患者T细胞亚群的变化 治疗后患者外周血T细胞亚群显示、、、均有升高，NK细胞 (双阳性细胞)较治疗前明显上升(见表2)。

表1 CIK细胞培养过程中表型的变化(±s，% ，n=15)Table1 The alteration of immunophenotype during the cultivation of CIK cells

表1 CIK细胞培养过程中表型的变化(±s，% ，n=15)Table1 The alteration of immunophenotype during the cultivation of CIK cells

注:与D0比较，*P＜0.01

CD+3 CD+8 CD+3 CD+56 D0 21.38±2.46 6.08±3.16 D11 40.67±4.56* 31.18±4.56*D13 42.14±5.37* 31.08±2.47*D15 54.27±6.90* 41.56±6.54*F 6.82 5.37 P值值＜0.05 ＜0.05

2.4 疗效 15例患者共经45个疗程(每个疗程间隔2～3个月)，经1个疗程治疗后憋气症状均明显减轻，疗程间隔期不需继续抽取胸腔积液，14例患者2～3个疗程后复查胸部CT，胸腔积液较前明显减少，其中1例乳腺癌肺转移患者治疗2个疗程后因加入其他药物临床协作组退出治疗，1例急性白血病患者治疗1个疗程后因原发病复发，放弃治疗自动出院，1例肺癌患者治疗2个疗程后出现肺内转移转肿瘤内科继续治疗，其余患者治疗后2个月内不再接受化疗及放疗，现已随访6～28个月，病情呈稳定状态。

3 讨论

生物治疗是目前治疗肿瘤的重要措施，其中细胞免疫治疗是研究的热点之一。细胞免疫治疗的研究始于20世纪80年代，人们陆续研究了淋巴因子激活的杀伤 (LAK)细胞、肿瘤浸润淋巴 (TIL)细胞、CD3单克隆抗体 (单抗)激活的杀伤 (CD3AK)细胞等，体外研究均具有一定的杀瘤活性，但是由于细胞的扩增倍数低，细胞毒力不强，故其临床应用受到很大的限制。1991年，Schmidt－wolf等［3］首先报道了 CIK细胞。它是将人外周血或骨髓单个核细胞在体外用多种细胞因子与CD3单抗共同培养一段时间后获得的一组异质细胞，也称自然杀伤 (NK)细胞样T淋巴细胞，CIK细胞在外周血淋巴细胞中的比例为1%～5%。其主要效应细胞表面既有T细胞表面标志 (CD3)，也有NK细胞表面标志 (CD+56)，因而兼有T淋巴细胞抗瘤活性和NK细胞非人类主要组织相容性复合体 (major histocompatibility complex，MHC)限制性杀瘤的特点。应用CIK细胞治疗因其可大量扩增，细胞毒活性强，可杀伤自体和异体多种肿瘤细胞，而且克服了过去过继免疫疗法的不足，如体外增殖数量少、需输注白介素－2、低效及副作用大等，现已经成为肿瘤生物治疗的一种新方法。CIK细胞具有很强的细胞毒活性，源于其较高的存活率和强大的增殖能力。CIK细胞对靶细胞的识别结合是非T细胞受体 (TCR)和非MHC限制的。目前关于CIK细胞杀伤靶细胞的原理尚未完全阐明，可能是通过黏附因子LFA/ICAM－1途径与肿瘤细胞结合后，分泌含大量BLT酯酶的颗粒，这些颗粒能穿透靶细胞膜，导致肿瘤细胞的裂解［3］;而且 CIK细胞还能分泌白介素－2，白介素－6，肿瘤坏死因子－α及粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子 (GMCSF)等一些细胞因子，增强细胞毒作用;CIK细胞同时可以上调CD2、CD18等黏附分子的表达，增加效应细胞的免疫作用。此外，CIK细胞还可通过直接靶向肿瘤细胞进行杀伤或诱导其凋亡。

表2 免疫治疗前后患者T细胞亚群的变化(±s，%，n=15)Table 2 The alteration of T cell subset in patients of pre－immunotherapy and after－immunotherapy

表2 免疫治疗前后患者T细胞亚群的变化(±s，%，n=15)Table 2 The alteration of T cell subset in patients of pre－immunotherapy and after－immunotherapy

CD+3 CD+4 CD+8 CD+19 CD+16 CD+56治疗前 55.89±6.45 21.89±2.89 30.67±4.56 8.56±2.12 16.21±4.07治疗后 73.47±2.56 39.05±6.45 33.25±6.74 45.67±3.85 39.04±7.32 t 5.65 3.98 2.79 8.96 5.47 P值值＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

Schmidt－ Wolf［3］和黄文荣等［4］研究均发现CIK细胞不是单一种类的细胞群，而是几种细胞的混合群体。其主要细胞成分是细胞和细胞。CIK细胞来源于的T淋巴细胞在特定的细胞因子及环境下刺激形成，而不是体内原来就存在的细胞或的NK细胞。有实验进一步证明CIK细胞主要来源于T淋巴细胞。T淋巴细胞又称为细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)，主要作用是特异性直接杀伤靶细胞［5］。在本研究中，发现在细胞培养过程中，随着培养时间的延长，除双阳性细胞的百分含量大幅度上升外，双阳性细胞的百分含量亦有明显的上升。这种自身CIK细胞对自身及异基因肿瘤细胞均有杀伤作用，并且在体外大量扩增后回输体内，不需同时用白介素－2，故副作用小，因此有潜在的临床研究与应用价值［6］。在我们的前期研究中，应用血细胞分离机采集患者外周血单个核细胞，其中贴壁细胞培养树突状细胞 (DC)，悬浮细胞培养CIK细胞，DC采用淋巴引流部位皮下注射，CIK细胞经静脉全身输注，该种治疗与传统的DC－CIK细胞混合培养后静脉全身应用相比，避免了不成熟DC静脉应用可能导致的免疫耐受，提高了治疗效果［7］。由于DC、CIK细胞混合应用治疗费用较高，对于经济较困难患者，我们采用单纯CIK细胞培养，并在以往恶性肿瘤类型研究的基础上，进一步扩大了恶性肿瘤的类型 (如急性白血病等)及患者的治疗例数，除将CIK细胞静脉全身应用外，我们首次采用CIK细胞联合白介素－2胸腔内注射直接到达患处杀伤肿瘤细胞，不仅患者治疗前后外周血T细胞亚群显示NK细胞双阳性细胞)较治疗前明显上升，主动抗肿瘤的免疫功能提高，患者的临床症状、影像学均提示病变较前好转，提示该种治疗方法对癌性胸腔积液是安全有效的，有良好的应用价值。