外源性皮质酮对大鼠主动脉内皮细胞热休克蛋白90表达的影响

王晓兵，张薇，田国祥

应激(stress)是指内外环境刺激超过正常阈值时，机体出现的一种包括神经、内分泌和免疫系统等在内的综合应答状态。在应激状态下，各种有机体都有其共同的分子反应，即正常基因表达的抑制和一组特殊基因——热休克蛋白基因的激活和表达，这导致热休克蛋白(HSP)的大量产生。血清皮质酮(CORT)增多是机体应激时的一个重要表现，应激时糖皮质激素(glucocorticoids，GC)分泌显著增多具有重要的生理意义，不仅可以调控炎症反应，而且还有参与机体能量代谢、提高血管对儿茶酚胺的敏感性以及稳定溶酶体膜等多种作用。本实验通过采用皮质酮对大鼠主动脉内皮细胞的干预，目的在于观察皮质酮对大鼠主动脉内皮细胞热休克蛋白90表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂 健康Wistar大鼠(清洁级)，体重(120±10)g，购自第三军医大学动物所;皮质酮购自Sigma公司;抗HSP90抗体购自Santa Cruz公司。Elx800型酶标仪为BIO2TEK公司产品;倒置光学显微镜(BX60)为德国Leica公司产品;PCR仪为Eppendorf公司产品。

1.2 模型制做及实验分组 采用大鼠主动脉“环”植块培养［1］大鼠主动脉内皮细胞及传代，实验用大鼠主动脉内皮细胞随机分为三组，分别为正常组、量效组和时相组，量效组加入终浓度分别为0.1μM、50μM和100μM的CORT，分别继续培养2 h、4 h、6 h、12 h、24 h和72 h后收集细胞并做进一步实验。

1.3 Bradford法测定细胞总蛋白含量［2］以牛血清白蛋白(BSA)为测量标准蛋白质，并将其配置成0.5 mg/ml溶液。取5支EP管分别加入0.5 mg/ml BSA 5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，再加0.15 mmol/L NaCl补足至 100μl;另取一支 EP管加入 100μl 0.15 mmo1/L NaCl作为空白对照。然后，每支EP管中各加入1 ml考马斯亮蓝G-250染液，充分混匀，室温下放置2 min，用1 cm光径的比色杯测595 nm波长处的吸光度(A595)，以A595与对应的标准BSA浓度作标准曲线。再以同样的方法测量待测蛋白样品的A595，对照标准曲线计算出样品蛋白含量。

1.4 细胞总RNA的提取及RT-PCR PCR引物设计与合成:从GenBank中查找大鼠HSP90和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因序列，应用Primer 4.0引物设计软件，按照引物设计的基本原则，并优选跨不同外显子的一对引物。设计好的引物由上海生物工程公司合成。HSP90引物序列:上游引物5＇TTGAGCCCATTGATGAGTATTG 3＇;下游引物5＇GGGTTTATCTCCAGGTGTTTCT 3＇。GAPDH引物序列:上游引物5＇-GTGACTTCAACAGCAACTCCCATTC-3＇;下游引物5＇-GTTATGGGGTCTGGGATGGAATTGTG-3＇。

1.5 统计学分析 采用SPSS 12.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间差异采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 皮质酮干预后大鼠主动脉内皮细胞总蛋白中HSP90的含量及量效动态变化 Western blot检测结果显示:皮质酮干预内皮细胞2 h后，干预浓度不同的各组(0.1μM、50μM和100μM)，内皮细胞总蛋白中HSP90的含量显示明显增加，皮质酮干预内皮细胞6 h后，各组内皮细胞总蛋白中HSP90的含量达到峰值，其中干预浓度为0.1μM组HSP90的蛋白含量增加最为明显，皮质酮干预内皮细胞72 h后，0.1μM组、50μM和100μM组HSP90的蛋白含量仍有少量表达(图1、2、3)。

图1 皮质酮干预后大鼠主动脉内皮细胞总蛋白中HSP90的含量及量效动态变化(n=5)

图2 皮质酮干预后大鼠主动脉内皮细胞总蛋白中HSP90的含量(0.1μM组)

图3 皮质酮干预后大鼠主动脉内皮细胞总蛋白中HSP90的含量(6 h组)

2.2 皮质酮干预后大鼠主动脉内皮细胞HSP90 mRNA水平的表达 根据蛋白水平的表达变化情况，通过PCR重点检测了未干预组和皮质酮干预6 h(0.1 μM组)大鼠主动脉内皮中HSP90 mRNA表达结果显示，未干预组HSP90 mRNA表达较弱，皮质酮干预6 h后，其表达显著提高，HSP90 mRNA表达水平分别为(0.66±0.07)ODu×mm2、(7.42±0.19)ODu×mm2，两组比较有显著统计学差异(P＜0.01)(图4)。

图4 皮质酮干预6 h后HSP90 mRNA的表达变化(0.1μM组)

3 讨论

HSP90是目前研究较多的一类热休克蛋白，HSP90为生物进化过程中一种高度保守的蛋白质，主要存在于细胞浆，约占胞浆蛋白的1%～2%。在真核动物细胞中，HSP90的缺失会导致细胞的死亡。人类HSP90以是否富含谷氨酰胺片段分为α和β两种主要类型，分别由不同基因编码，其中HSP90α基因包含11个外显子和10个内含子。HSP90β基因位于6p21。对HSP90β基因的进一步研究发现，在其转录起始位置上游包含由1102个碱基对组成的区域，整个基因包含12个外显子和11个内含子，外显子长度介于99～396个碱基对之间，而内含子为91～1433个碱基对，目前已鉴定出的6个热休克元件中有3个位于第一内含子里。人类HSP90家族的HSP90α和HSP90β的cDNA在1989年被克隆，它们分别转录形成不同的mRNA。已知HSP90α和HSP90β基因的第一个外显子是不能翻译为蛋白质的。一般情况下，HSP90α易受热诱导，HSP90β易受有丝分裂的诱导。在高温、创伤等因素刺激时内脏组织中以HSP90α表达升高为主。

类固醇激素在未被活化时都与HSP90结合，类固醇激素与受体结合需要HSP90，在没有激素作用时，2分子HSP90与1分子类固醇激素受体结合，使受体处于非活性状态，此时的受体虽然不能与细胞核内的DNA结合来调节转录，但HSP90可以让受体维持在一个激素配体结合状态中。Picard等［3］利用哺乳动物的类固醇激素受体可以在酵母细胞中发挥作用，而酵母的HSP90含量容易调节这一特性，下调HSP90含量二十多倍后发现，在HSP90含量很低的情况下，受体大多未与HSP90结合。研究表明HSP90是糖皮质激素受体(GR)，的一种重要的伴侣蛋白，影响着GR活性和功能［4-7］。生理状态下，GR与HSP90等分子伴侣结合而存在于胞浆中，HSP90遮盖了GR的DNA结合部位，阻滞GR活性，GC进入细胞后与GR的C端结合，GR发生温度依赖性立体构型变化，HSP90等被解离，DNA结合部位得以暴露，抑制活性被解除，成为能与DNA结合的活化型受体。这种活化的GR与GC一起向核内移行，与细胞核靶基因中特定的GRE结合，诱导生成特异性mRNA，指导特定蛋白质合成，发挥其生物效应。进入细胞核内的GR在发挥完其转录激活作用后，又会返回胞浆中，并与HSP90等分子伴侣结合，等待再次被GC激活。研究发现用HSP90抑制剂可以减弱地塞米松诱导的糖皮质激素受体核转位，并影响一些前炎症因子的活化，从而进一步提示HSP90在类固醇激素信号转导中的重要作用。HSP90有两个富含负电荷区域，一个位于中央铰链区，是真核细胞所特有的，参与和糖皮质激素受体等靶蛋白的结合。该区还有核定位信号(NLS)，可能参与类固醇激素受体的细胞浆-细胞核穿梭。因此，细胞内的GR一直是处于循环再利用状态，而HSP90在其循环过程中起着至关重要的作用。

本实验结果显示，皮质酮干预内皮细胞2h后，干预浓度不同的各组(0.1μM、50μM和100μM)，内皮细胞总蛋白中HSP90的含量显示明显增加，皮质酮干预内皮细胞6 h后，各组内皮细胞总蛋白中HSP90的含量达到峰值，其中以0.1μM组HSP90的蛋白含量增加最为明显。皮质酮干预内皮细胞72 h后，0.1μM组、50μM和100μM组HSP90的蛋白含量仍有少量表达。本实验采用皮质酮干预大鼠主动脉内皮细胞后，观测不同时相点和不同量效点大鼠主动脉内皮细胞热休克蛋白90表达的改变，通过本部分实验研究显示外源性皮质酮可以促使大鼠主动脉内皮细胞HSP90表达显著增加。

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