葡萄酒野生优良酵母菌株的筛选

张敬慧 (宜宾职业技术学院,四川宜宾644003)

汤钦林 (荆州职业技术学院,湖北荆州434020)

葡萄酒是采用新鲜葡萄或葡萄汁经完全或部分酒精发酵而得到的饮料。葡萄酒的酿造是通过酵母菌的作用,将葡萄原料中的各种潜在质量在酒中充分图现出来[1]。葡萄酒具有开胃健脾、防治心血管病、防癌作用、杀菌作用、葡萄酒养颜益寿等作用,随着人们生活水平的提高,酒饮料的保健功能越来越受到人们的重视,中高端葡萄酒的品质也受到众的关注。葡萄酒的品质除了取决于原料和酿制工艺外,酿酒酵母菌的品质也直接影响葡萄酒的产量和质量。优良葡萄酒酵母应具有生长速率快、耐高糖、耐SO2、耐酸、发酵平稳、酒精产率高、发酵完全等特性[2]。本研究根据宜宾本地特色,从土壤中选育出适合于葡萄酒生产的菌株,对于充分利用本土微生物资源,开发特色优质葡萄酒具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

(1)菌株 供试的4株野生酿酒酵母菌菌株分别从四川宜宾2个酿酒葡萄产区生产土壤中采集,并经分离纯化后得到的,分别命名为Yp-1、Yp-2、Yp-3、Yp-4。对照菌株是由当地葡萄酒生产企业提供的活性干酵母。

(2)培养基 菌体培养用固体培养基为马铃薯培养基、MEA培养基[5];发酵培养基[6]为宜宾2010年产赤霞珠葡萄汁,pH3.5～3.6,糖度0.41～0.43g/mL。

1.2 方法

(1)酵母菌的纯化 用五点取样法从葡萄地土壤中取样,用四分法获取样品20～30g,压碎后放入盛有40mL无菌水的250mL三角瓶[3],取上清液1mL,依次按平板稀释法进行稀释,从10-3mg·L-1开始马铃薯培养基平板培养,直到出现单个菌落。挑取单个菌落,用MEA培养基进行分离。每皿加青霉素300mg·L-1,25～28℃培养,重复纯化培养直到获得纯菌落。

(2)酵母菌的耐性试验 采用乙醇体积分数分别为11%、13%、15%、17%、18%,柠檬酸pH分别为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5,葡萄糖浓度分别为 0.37、0.40、0.43、0.47、0.50g/mL。SO2浓度分别为10、15、20、25、30mg·L-1的带有杜氏管的液体培养基10mL,分别接种已活化的菌液200μ L,接种量为106个/mL,25℃温度培养,记录各单因素耐性试验条件下各酵母菌株的72h产CO2量与启动发酵的时间。

2 结果与分析

2.1 乙醇体积分数对各酵母菌株发酵的影响

从图1可以看出,随着乙醇体积分数的升高,野生菌启动发酵的时间推迟,其中菌株Yp-3、Yp-4在同等条件下启动发酵最快。菌株Yp-3、Yp-4与对照菌株比较发酵启动时间很接近,在乙醇体积分数为15%左右时,所有菌株发酵启动时间相对最短。但当乙醇体积分数≥18%时,各菌株均不能启动发酵。

图1 不同体积分数乙醇下各酵母菌株启动发酵的时间

从图2可以看出,菌株Yp-3、Yp-4在乙醇体积分数低于15%左右的条件下产气能力良好,在乙醇体积分数为17%的条件下仍可产少量气体,与对照菌株活性干酵母性能接近。而菌株Yp-1、Yp-2在乙醇体积分数为15%的条件下产气量下降明显,可能是由于酵母生长受抑制,图2表明其耐受力较差,而菌株Yp-1在乙醇体积分数为17%的条件下几乎不产气,对乙醇的耐受力最差。乙醇体积分数为17%的条件对所有酵母菌株的生长繁殖具有明显抑制作用,在野生菌中菌株Yp-4相对耐受力最好。在乙醇体积分数为18%时所有菌均不生长,酵母耐受性降低可能是CO2毒性所致。

图2 不同体积分数乙醇下各酵母菌株的72h产CO2量

2.2 SO2浓度对各酵母菌株发酵的影响

葡萄酒生产过程中,需加入适量的SO2,达到抑制有害微生物、抗氧化、护色等作用。优良葡萄酒酵母需在SO2浓度为15～20mg·L-1的条件下均能较好地抑制杂菌,保证正常发酵。

图3表明,4株野生菌在SO2浓度为10～25mg·L-1的条件下均能启动发酵,且时间接近,为7～12h。相对而言,菌株Yp-3、Yp-4与对照活性酵母菌的启动时间更接近。

从图4可以看出,不同SO2浓度对酵母产气效果影响不是特别大,均能产气,当SO2浓度为20mg·L-1时菌株Yp-1、Yp-4产气效果相对最好,证明野生酵母菌发酵产气最适SO2浓度在20mg·L-1左右。

图3 不同SO2浓度下各酵母菌株启动发酵的时间

图4 不同SO2浓度下各酵母菌株的72h产CO2量

2.3 葡萄糖浓度对各酵母菌株发酵的影响

在葡萄糖浓度为0.37～0.50g/mL条件下,各菌株都能启动发酵;但随着葡萄糖浓度增加,启动速率会下降,启动时间会延迟 (图5)。

图5 不同葡萄糖浓度下各酵母菌株启动发酵的时间

当葡萄浓度高于0.50g/mL时,菌株Yp-1和Yp-4发酵产CO2量相似,启动时间也较接近。证明这2种野生菌耐高糖的能力较强。

2.4 pH对各酵母菌株发酵的影响

由图8可以看出,当pH在2.0时,菌株Yp-3、Yp-4和活性干酵母能启动发酵外,其余野生菌均不能启动发酵,菌株Yp-3、Yp-4较其他菌株具有更强的耐酸性。不同酸度条件下各酵母菌株的72 h产CO2量相差较小。总体来看,起酵时间随pH的降低而逐渐延长。当pH3.5左右时,酵母菌发酵效果相对较好。

图6 不同葡萄糖浓度下各酵母菌株的72h产CO2量

图7 不同pH条件下各酵母菌株启动发酵的时间

图8 不同 pH条件下各酵母菌株的72h产CO2量

3 小结

本研究结果表明,4株野生菌对高乙醇、高葡萄糖浓度等条件均具有较好的耐受性,能够启动酒精发酵进程。但菌株Yp-1、Yp-2、Yp-3在同等酸度梯度下发酵启动时间长且不能耐受酸,因此予以淘汰。综合各项发酵性能,Yp-4对乙醇的耐受性优于其他菌株,并在高酸的条件下能够较快启动发酵,与现有的活性干酵母耐受性相近,为最优菌株,更适宜宜宾当地葡萄酒的生产。

[1]李记明.酵母活性剂在葡萄酒酿造中的应用研究[J].酿酒科技,2001,(4):88-89.

[2]程 超,韩北忠,陈晶瑜,等.本土葡萄酒酿酒酵母发酵性能的比较 [J].中国酿造,2008,(17):9-10.

[3]战景娟,金勇键.山葡萄选育酵母的应用 [J].酿酒,2004,3l(2):80-81.

[4]秦伟帅,王海燕,李 超,等.不同葡萄酒酵母耐受性试验比较 [J].中外葡萄与葡萄酒,2009,17(9):16-19.

[5]王 慧,张立强,刘天明,等.产地葡萄酒优良酵母菌株的筛选及鉴定 [J].酿酒科技,2007,(9):29-34.

[6]吴 帅,肖冬光,原通磊,等.高耐性酿酒酵母菌种的筛选 [J].酿酒科技,2006,(9):37-39.