2种佐剂在传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗中的应用比较

蔡联燊,荣 俊 (长江大学生命科学学院,湖北荆州434025)

鸡传染性法氏囊病 (infectious bursal disease,IBD)是一种急性、高度接触传染性的病毒病。它是由传染性法氏囊病病毒 (infectious bursal disease virus,IBDV)引起的鸡的免疫抑制性传染病[1]。IBD给家禽业造成巨大经济损失,尚无特效药可以治疗,目前主要应用疫苗进行预防。所用疫苗主要为灭活疫苗和冻干活疫苗以及新型的基因工程亚单位疫苗[2],其中传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗具有较好的免疫原性,副作用相对较低,是一种应用前景广阔的禽病疫苗[3]。

疫苗佐剂是动物疫苗中的重要组成部分,是一种非特异性免疫增强剂,可增强机体的免疫应答能力或改变免疫应答的类型。佐剂一方面能增强疫苗免疫效果,另一方面也会引起被免疫动物产生一些局部或全身副反应。选择合适的佐剂,对于提高疫苗免疫效果和减少不良反应有重要的意义[4]。为了进一步提高传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的免疫效果和安全性,本研究以SPF鸡为试验动物,对2种不同的动物疫苗佐剂:白油佐剂和603新型纳米佐剂应用于传染性法氏囊病亚单位疫苗中的免疫效果和安全性进行了比较,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

白油佐剂:由94%(V/V)矿物油、6%(V/V)的Span-80,2%(m/V)硬脂酸铝配置而成;603新型纳米佐剂:由赛百瑞 (北京)生物技术有限公司提供。

VP2蛋白:以长江大学大学生命科学学院分子生物学实验室保存的IBD亚单位疫苗工程菌种 (专利菌种)进行诱导表达而得[5],经过纯化后作为制备疫苗用抗原。IBDV琼脂免疫扩散试验AGP检测用抗原及阳性血清:购自中国兽医药品监察所。

所用SPF鸡由购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司的SPF种鸡蛋,在实验室以实验用孵化器进行孵化而得,孵出后放入消毒的隔离器中进行饲养和试验。

1.2 不同佐剂IBD亚单位疫苗的制备

本研究共制备4种传染性法氏囊病亚单位疫苗:分别是VP2抗原效价为1∶32和1∶16的白油佐剂疫苗,分别编号为1号疫苗和2号疫苗,抗原效价为1∶32和1∶16的603纳米佐剂疫苗,分别编号为3号疫苗和4号疫苗。并设2组不同佐剂配置的空白对照疫苗,白油佐剂对照疫苗编号为5号疫苗,纳米佐剂对照疫苗编号为6号疫苗。各种疫苗成分详见表1。

表1 不同抗原效价和佐剂传染性法氏囊病亚单位疫苗的成分

制备白油佐剂传染性法氏囊病亚单位疫苗时,将制备好的VP2抗原和吐温-80,充分混匀,30℃,静置60min。再与制备好的白油佐剂按表1比例混合,在乳化机内进行乳化。分装后2～8℃保存[6]。制备纳米佐剂传染性法氏囊病亚单位疫苗时,按表1将各组分混匀,在乳化机内进行乳化。

1.3 佐剂的免疫效果试验

将36只45日龄SPF鸡分成6组 (A、B、C、D、E、F),每组6只。A～F各组鸡分别注射1～6号疫苗,即其中A组、B组为白油佐剂组,C组、D组为纳米佐剂组,E组、F组为对照组。所有鸡均颈部皮下注射,剂量为0.2ml/只。在免疫接种14d、21d后分别对试验鸡进行采血,血样8000 r/min离心5 min分离血清,参照文献 [7]通过琼脂免疫扩散试验检测血清IBDV抗体。

1.4 佐剂的安全性试验

将36只45日龄SPF鸡随机分成6组 (a、b、c、d、e、f),每组6只。a～f各组鸡分别注射1～6号疫苗,即其中a组、b组为白油佐剂组,c组、d组为纳米佐剂组,e组、f组为对照组。所有鸡均颈部皮下注射,剂量为1ml/只。试验鸡安全性检测通过以下2个方面进行判断:①观察鸡在免疫接种后的食欲、精神状态及其恢复情况;②在免疫接种后21d,对鸡进行剖杀,观察注射部位病理变化情况。

2 结果与分析

2.1 不同佐剂IBD亚单位疫苗的免疫效果

各组试验鸡免疫接种14d、21d后血清IBDV抗体检测结果见表2。

表2 不同免疫组鸡接种 14d、21d后血清平均IBDV抗体水平

由表2可知,白油佐剂组2种不同抗原剂量刺激产生的抗IBDV VP2抗体水平均高于对应的等剂量的纳米佐剂组。白油佐剂的2个疫苗免疫组中,抗原量增加使抗体的水平提高明显,如在免疫14d时,注射抗原效价为1∶32的疫苗的SPF鸡,其IBDV抗体均效价为28.8,而注射抗原效价1∶16的疫苗的SPF鸡,其IBDV抗体均效价为19.6。但该规律在纳米佐剂疫苗中表现并不明显,如在免疫14d时,注射抗原效价1∶32的纳米佐剂疫苗的SPF鸡,其IBDV抗体平均效价为9.6,而注射抗原效价1∶16的纳米佐剂疫苗的SPF鸡,其IBDV抗体均效价为10.4。试验SPF鸡注射白油佐剂疫苗后14d到21d期间,IBDV抗体水平呈明显上升趋势,而注射纳米佐剂疫苗后14d到21d期间,抗体水平维持不变或下降。说明603号纳米佐剂为水性佐剂,注射进入动物体后迅速吸收,很快使抗体达到峰值,然后又迅速消退。

此结果表明,白油佐剂传染性法氏囊病亚单位疫苗的免疫效果明显优于纳米佐剂传染性法氏囊病亚单位疫苗,并且在免疫后抗体水平稳定性方面,也是前者明显优于后者。

2.2 不同佐剂IBD亚单位疫苗的安全性

不同组SPF鸡注射不同佐剂疫苗后的全身反应没有明显区别。24 h内基本采食减少,行动迟缓,应激性较差;24～48 h,采食增加,行动应激逐渐恢复;48 h后采食及精神基本恢复正常。在免疫21d,对SPF鸡进行折颈处死后剖检,以肿块大小或其他病变≤1cm×1cm为安检合格,检测结果见表3。

表3 不同免疫组鸡接种21d后安检合格率

从剖检结果来看,2种不同佐剂的副反应情况并不相同,白油佐剂组的a组和b组的疫苗吸收情况不理想,形成肉芽病变肿块;而纳米佐剂组的c组和d组的疫苗吸收较好,未形成肉芽病变肿块。并且603新型纳米佐剂组的病变范围要明显小于白油佐剂组。在白油佐剂组中,a组的安检合格率要略低于b组;在纳米佐剂组中,c组和d组的安检合格率没有明显区别。此结果表明,纳米佐剂传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗与白油佐剂法氏囊病基因工程亚单位疫苗比较,前者产生较小的副反应,安全性明显优于后者。

3 讨论

本研究结果表明:在增强免疫效果方面,白油佐剂要明显优于纳米佐剂;在安全性方面,纳米佐剂要明显优于白油佐剂。白油佐剂为油乳佐剂,它的作用机制是抗原包被在油相形成的微结构中,使之形成贮存库而缓慢释放,刺激机体免疫细胞持续性产生抗体[8],所以使动物获得较高的抗体水平。但是,白油佐剂制备的疫苗在动物体内不易扩散吸收,所以产生较大的局部副反应。603新型纳米佐剂是采用纳米技术加工而成的纳米颗粒,其直径通常介于50～200nm之间[9],试验结果表明其安全性好、免疫效果差,原因可能由于其为水性佐剂,在动物体内易于扩散,所以在局部产生的副反应较小;但是也由于其易于扩散的特性,所以无法持续刺激动物免疫系统而得到较高的抗体水平。在选择佐剂的时候,应根据不同佐剂的特性和不同疫苗制备的需要,选择合适的佐剂。

[1]Wyeth P J,Cullen G A.M aternally derived antibody-effect on susceptibility of chicks to infectious bursal disease[J].Avian Pathol,1976,5:253-260.

[2]赵怀龙,贾世玉,陈如明.鸡传染性法氏囊病基因工程疫苗研究进展 [J].中国生物制品学杂志,2005,18(11):538-540.

[3]程太平,荣 俊,孙中杰.传染性法氏囊病重组亚单位疫苗的田间试验 [J].吉林畜牧兽医,2007,28(8):8-10.

[4]穆 杨,周丽梅,侯宏虎,等.三种佐剂对鸡体液免疫影响的比较[J].动物医学进展,2007,28(10):37-39.

[5]Rong J,Jiang T,Cheng T P,et al.Large-scale manufacture and use of recombinant VP2 vaccine against infectious bursal disease in chickens[J].Vaccine,2007,25:7900-7908.

[6]程太平,荣 俊,王怀林.传染性法氏囊病重组亚单位疫苗保存期试验 [J].安徽农业科学,2006,34(21):5554-5555.

[7]白文彬,于康震.动物传染病诊断学 [M].北京:中国农业出版社,2002:138-142.

[8]赵 萍,储岳峰,高鹏程,等.免疫佐剂的研究现状及发展动态 [J].中国兽禽种业,2008,(13):66-68.

[9]赵 卓,潘延钵,邓玉芹,等.用新型纳米佐剂配置猪伪狂犬病灭活疫苗的免疫效果研究 [J].动物保健品,2010,(1):144-146.