蛋白激酶C在肺缺血预处理保护中的作用

张郁林，黄烨，周波，杨卫东，聂军，李奎，万沛

(宜昌市第一人民医院心胸外科，湖北宜昌 443002)

缺血预处理(ischemia preconditioning，IPC)是机体一种内源性保护机制，已在动物和临床病人[1]中得到证实，但相关机制却不明。大量研究证实，蛋白激酶C(PKC)参与心肌等[2]多种器官的IPC保护效应，PKC是否参与肺IPC保护效应目前还不能定论。本实验通过建立在体单侧肺原位缺血/再灌注(I/R)模型[3]，探讨PKC在肺IPC保护中的作用，并探讨IPC的可能保护机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型

大鼠以1%戊巴比妥钠50 mg·kg－1腹腔麻醉，肌肉注射硫酸阿托品针剂0.2 ml，气管插管后接小动物呼吸机，通气压力为 10 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)，吸呼比为1∶2，频率 70 次·min－1，潮气量 10 ml，氧浓度100%。取右侧卧位，经左前侧第5肋间开胸，解剖出左肺门并留置阻断带。按 Sekido方法[4]复制在体大鼠肺I/R模型，即用结扎法完全阻断左肺门一段时间后，恢复其血供和通气，其间保持左肺湿润，肝素100 U经阴茎背静脉注射，予生理盐水皮下注射0.5 ml·h－1。取左全肺组织分别送检。

1.2 分组

雄性SD大鼠50只，体重200～400 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，随机分5组。假手术(Sham)组(S组，n=10):左肺门游离后，不阻断左肺门，观察165 min后取左全肺;I/R组(n=10):左肺门游离后，观察45 min，再阻断左肺门60 min，后开放再灌注60 min，再取左全肺;IPC组(n=10):左肺门游离后，阻断左肺门5 min，松开10 min，重复3次(即IPC 45 min)，以后同 I/R组;多黏菌素 B(polymyxin B，PMB)组(n=10):左肺门游离后观察45 min，并在此时间内经尾静脉注射PMB生理盐水1 ml(PMB购自古泰生物公司，批号0319，剂量为 2 mg·kg－1)，以后同I/R组;IPC+PMB组(n=10):左肺门游离后，在45 min的IPC过程中静脉注射PMB生理盐水液1 ml(PMB同上)，以后同I/R组。

1.3 肺组织超氧化物歧化酶活力及丙二醛含量的测定

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力测定采用黄嘌呤氧化酶法:取肺组织匀浆液0.1 ml，加入反应液后测定其在550 nm处的吸光度值，考马斯亮蓝蛋白测定法检测肺组织匀浆液中蛋白浓度。丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量测定采用巴比妥酸法:取肺组织匀浆液0.1 ml，加入反应液后测定其在532 nm处的吸光度值，考马斯亮蓝蛋白测定法检测肺组织匀浆液中蛋白浓度。

1.4 肺组织损伤定量评价

1.4.1 肺湿干重比(W/D)测定 实验末取送检后剩余肺组织称重为肺湿重，于70℃烘箱烤24 h后称重为肺干重，计算出W/D。

1.4.2 肺泡损伤数比值测定 肺组织多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，每个标本5张切片，任取1张，光镜下观察10～15个视野(200倍)的肺泡总数，根据Murata方法[5]计算肺泡损伤数，即每个肺泡中细胞总数(白细胞或红细胞)超过2个以上视为肺损伤，损伤的肺泡数与总的肺泡计数的比值为肺泡损伤数比值(injured alveoli rate)。

1.5 肺组织超微结构观察

实验末，每组取4例，在肺门横切面取1 mm×1 mm×1 mm大小肺组织2～3块，用2.5%戊二醛预固定，1%锇酸后固定，常规脱水、包埋、超薄切片，常规染色，透射电镜(荷兰FEI Tecnai G212型)观察。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组SOD活力、MDA含量、W/D和肺泡损伤数比值之间的比较

与S组相比，I/R组SOD活力下降、MDA含量升高、W/D升高、肺泡损伤数比值升高(均P＜0.01);与I/R组比较，IPC组SOD活力升高、MDA含量降低、W/D降低、肺泡损伤数比值降低(均P＜0.01);与I/R组比较，PMB组和IPC+PMB组各项指标差异无统计学意义(均P＞0.05)。见表1。

2.2 肺组织病理学改变

I/R组、PMB组和IPC+PMB组肺组织损伤明显，光镜下见肺泡间隔增宽明显，肺泡间隔的毛细血管以及肺间质内的小静脉扩张、充血。肺间质和肺泡腔有较多炎症细胞渗出。肺泡腔内充满均匀红染的水肿液，并可见多数“心衰竭细胞”，其胞质内含粗大的黄褐色的含铁血黄素颗粒。电镜下可见肺泡腔内有密集絮状物渗出和大量血细胞，毛细血管及肺内小血管内血细胞密集、挤压。血管内皮细胞、肺泡Ⅰ型上皮细胞以及气-血屏障结构大致正常，肺泡Ⅱ型上皮细胞数量减少，板层小体数量减少，多数空泡化，线粒体肿胀，部分微绒毛脱落。IPC组肺组织损伤较I/R组明显减轻，S组肺组织结构基本正常。见图1～3。

表1 各组SOD活力、MDA含量、W/D和肺泡损伤数比值之间的比较(±s，n=10)

表1 各组SOD活力、MDA含量、W/D和肺泡损伤数比值之间的比较(±s，n=10)

a与S组比，P＜0.01;b与I/R组比，P＜0.01;c与IPC组比，P＜0.01

组 别 SOD/U·mg－1·pro－1 MDA/nmol·mg－1·pro－1 W/D 肺泡损伤数比值26.644 4 ±6.216 2 I/R 组 1.710 6 ±0.100 5a 2.687 6 ±0.161 0a 6.147 8 ±0.119 1a 52.512 8 ±6.914 9a IPC 组 1.907 1 ±0.079 4b 2.154 8 ±0.058 9b 5.204 4 ±0.057 3b 27.151 7 ±4.812 6b PMB 组 1.670 2 ±0.104 6c 2.718 7 ±0.122 3c 6.064 9 ±0.127 1c 53.100 0 ±1.565 0c IPC+PMB 组 1.670 0 ±0.085 3c 2.653 1 ±0.149 1c 6.046 6 ±0.133 2c 53.483 1 ±2.200 4/%S 组 1.878 3 ±0.078 2 2.113 1 ±0.100 2 5.289 0 ±0.153 8 c

图1 各组肺组织显微镜照片Fig 1 The microscope photographs of five groups，lung tissue

图2 IPC对肺I/R的作用 ×5 000Fig 2 The effect of IPC on I/R injury of lung(×5 000)

3 讨 论

IPC对组织器官I/R损伤有明显的防治作用，IPC能够启动机体的内源性保护机制。然而，迄今为止对IPC如何启动组织器官的内源性保护机制知之甚少，对肺的IPC研究起步较晚。既往有“腺苷学说”、“热休克蛋白学说”、“α1受体学说”、“氧自由基学说”等从不同方面描述IPC的可能机制。本实验研究发现，IPC能明显减轻肺I/R时的氧化损伤，表现为肺组织SOD活力升高、MDA含量降低、肺湿干重比下降、肺泡损伤数比值下降以及病理形态学上的改善，这些结果与相关文献报道[6-7]类似。

已有的研究表明，IPC发挥作用首先引起一些活性物质的释放，如腺苷、缓激肽、儿茶酚胺、血管紧张素Ⅱ等，这些物质能够与其相应受体结合，经G蛋白耦联激活细胞膜磷脂酶。活化的磷脂酶水解膜磷脂产生二酰甘油，与Ca2+协同作用使细胞内的PKC移到细胞膜而被激活。活化的PKC使相应底物蛋白磷酸化而发挥作用。本实验结果显示，IPC使PKC活化后，可降低氧自由基水平，减轻脂质过氧化反应;应用PKC抑制剂PMB后，IPC保护作用消失，IPC+PMB组各检测指标和病理学改变与I/R组无明显差异;而单独使用PMB时，PMB组各检测指标和病理学改变与I/R组也无明显差异。这说明PKC参与了肺IPC的保护作用。

PKC是一组广泛分布的、具有单一肽链结构的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞肌醇磷脂信号通路上起关键作用，在细胞生长功能上也发挥重要作用。它们参与激素释放、DNA及蛋白质合成、细胞分泌、细胞增殖分化、肌肉收缩等生理过程。PKC可以促进蛋白磷酸化是其介导IPC保护作用的基础。许多内源性物质，如腺苷、缓激肽、儿茶酚胺、血管紧张素Ⅱ、氧自由基等具有与PKC偶联的特点，可经不同途径激活PKC，活化的PKC作用于终末效应子，如内源性抗氧化酶、诱导型一氧化氮合酶、ATP敏感性钾离子通道、热休克蛋白等发挥保护作用。研究发现，PKC可以促进腺苷的合成[8]，后者具有广泛的生物学活性，可通过延缓能量消耗、减少中性粒细胞激活、减少超氧阴离子产生、抑制血小板聚集、刺激糖酵解等起到内源性保护作用。PKC还可以激活线粒体ATP敏感性钾通道[9]，降低细胞内钙超载程度，维持钙稳态，减少ATP的消耗，参与抗氧化反应。PKC还能激活丝裂原活化蛋白酶家族[10]，进一步激活核转录因子，启动基因转录与蛋白合成，发挥保护作用，其可能机制为凋亡作用[11-12]、抗氧化、蛋白修复[13]、抑制白细胞黏附激活、扩血管作用等。

目前发现PKC至少有12种同工酶亚型，分布在机体各组织细胞内，而且各种亚型在不同组织中的分布是不同的。已证实并非所有的 PKC亚型都参与了心肌IPC的保护作用，可能只是某些亚型发生了转位、激活。Armstrong等[14]使用选择性δ、ε亚型PKC激动剂ingenol预处理，可产生心肌保护作用，而选择性α亚型PKC激动剂thymeleatoxin预处理，没有产生有效的心肌保护作用。PKC是否参与肺IPC保护效应目前还无定论。对肺IPC保护效应的研究，王万铁等[15-16]发现，异丙酚、左旋精氨酸等通过上调肺组织PKC-α、δ、θ mRNA的表达，对肺I/R损伤产生保护作用。另外，有报道[17-18]称，PKC-α 介导急性肺损伤，应用PKC-α抑制剂对再灌注后肺组织具有一定的保护作用。因此，PKC在肺IPC保护中的作用机制还值得进一步研究。

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