实验性糖尿病酮症酸中毒家兔Ⅰ型肺泡上皮结构和功能变化的研究

顾小军，常家宝，朱晓云

(东南大学 附属第二医院，江苏 南京 210003)

糖尿病酮症酸中毒(diabetic ketoacidosis，DKA)是糖尿病常见的危重并发症。近年来的研究证实，肺是糖尿病高血糖损害的靶器官[1]。糖尿病高血糖可引起急慢性肺部感染(慢性支气管炎[2]、细菌性肺炎[3]、肺结核[4]、真菌感染[5]以及机会性感染[6])、肺功能下降(气体交换[7]及弥散功能[8]下降)、肺部肿瘤等肺部病变，即使是糖尿病倾向者也存在肺功能下降[9]，严重者可出现肺水肿[10]、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)[11]等而危及生命。目前研究DKA肺损伤的资料渐多，大部分资料集中于糖尿病肺功能[12]、免疫组化[13]及炎症因子[14]等的改变，部分资料研究了肺泡Ⅱ型上皮的变化[15]。但Ⅰ型上皮细胞为肺部主要组织细胞，是构成气血屏障的重要部分，其结构和功能的变化直接影响着气体的交换，而DKA时Ⅰ型肺泡上皮细胞器发生的超微结构和功能变化情况尚未明了。我们使用新西兰家兔制作了DKA模型，研究DKA家兔Ⅰ型肺泡上皮细胞的损伤情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通级新西兰雄性家兔12只，由江苏省农业科学院提供，体重1.65 ～3.25 kg。

1.2 实验材料

链脲佐菌素(STZ)、四氧嘧啶、细胞组化试剂均为Sigma公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 DKA模型制作方法 参照Harrs等[16]的方法，12只家兔随机分为实验组(DK组)和对照组(NS组)各6只，实验前常规测尿酮体、体重和血糖。所有动物予相同的饲养条件，DK组经耳缘静脉注射STZ 150 mg·kg－1和四氧嘧啶 150 mg·kg－1，NS 组予等剂量生理盐水。注射药物后 24 h 内按 0、1、3、6、12、24 h 测量血糖、体重，出现低血糖者予静脉补充葡萄糖液;24 h后每12 h测量血糖、尿酮体、体重，0.45%氯化钠加10%右旋糖酐按100 ml·kg－1补液。72 h后 DK组动物血糖皆大于16.7 mmol·L－1，尿中出现酮体。所有动物均清醒，氯胺酮0.05 g腹腔麻醉后检测动脉血气，处死取肺组织留取标本，进行透射电镜、细胞酶组化观察，研究Ⅰ型肺泡上皮溶酶体及细胞膜功能变化。

1.3.2 透射电镜标本的制备方法 标本采集后用2.5%戊二醛固定，常规电镜制样，超薄切片，电子染色，用日产H-600电子显微镜观察超微结构。

1.3.3 细胞组化法 依照Lewis等[17]的方法行电镜下碱性磷酸酶(ALP)检测:取下组织，固定在0.5%戊二醛和2%多聚甲醛固定液中。手工切片，厚度不超过40 μm，缓冲液冲洗。40 mmol·L－1tris(pH 9.2)，8 mmol·L－1β-甘油酸钠和 2.4 mmol·L－1硝酸铅中室温哺育，60 min后冲洗，后固定于锇酸中，环氧树酯包埋、超薄切片。不作染色，直接用电镜观察。每个样本都做阴性对照，仅不加甘油酸钠，其余各项均相同。

1.4 数据分析

2 结 果

2.1 两组实验前后血糖、体重、酮体及电解质变化

两组注药前后血糖和体重测定结果见表1，DK组符合DKA诊断标准。

表1 两组血糖和体重的变化(±s)

表1 两组血糖和体重的变化(±s)

a与 NS组相比，P ＜0.01;b 与治疗前相比，P ＜0.01

5.18 ±0.84 5.96 ±1.60 2.26 ±0.42 2.68 ±0.78 DK 组(n=6) 4.22 ±1.53 24.3 ±3.80a，b 2.43 ±0.75 2.34 ±0.15a，/kg治疗前 治疗后 治疗前 治疗后NS组(n=6)血糖/mmol·L －1体重组 别b

由表1可见，血糖值两组实验前差异无统计学意义，NS组实验前、后比较差异也无统计学意义，DK组实验后明显高于实验前(P＜0.01);体重的变化NS组实验前后为+0.42 kg，而DK组实验前后为－0.09 kg，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。尿酮体检测DK组注药前为阴性，注药后皆转为阳性，NS组注药前后未有变化。

注药后72 h，两组血浆渗透压、血气和血电解质测定结果差异均有统计学意义(均P＜0.01)，见表2。

2.2 NS组和DK组Ⅰ型肺泡上皮超微结构改变

NS组肺泡结构正常。DK组Ⅰ型肺泡上皮超微结构可见细胞膜结构模糊，细胞基底膜增厚、中断，细胞膜外可见大量高电子物沉积，肺泡膜明显增厚，血窦内可见红细胞与内皮细胞黏附等改变(图1)。

表2 两组血浆渗透压、血气和血电解质的比较(±s)

表2 两组血浆渗透压、血气和血电解质的比较(±s)

a与 NS组相比，P ＜0.05;b 与对照组相比，P ＜0.01

311 ±13.20 97.85 ±1.02 19.55 ±3.23 34.25 ±3.82 DK 组(n=6) 340.8 ±15.9a 58.9 ±2.31a 8.56 ±0.71b 27.55 ±6.29阴离子间隙NS组(n=6)组 别 血浆渗透压/mmol·L－1 动脉血氧饱和度/% 血浆碳酸氢根/mmol·L－1 a

图1 DK组Ⅰ型肺泡上皮细胞损伤 ×17 000

2.3 ALP 活性变化

NS组肺组织ALP活性位于细胞膜、线粒体上，见点线状着色、分布均匀、规则的颗粒(图2)。

图2 NS组Ⅰ型肺泡上皮细胞膜表面的ALP颗粒，沿细胞膜表面呈现规则的线状排列，分布均匀，细胞内的细胞器膜也有显示 ×12 000

DK组肺组织Ⅰ型上皮细胞膜上ALP颗粒消失，线粒体上活性变小;血管内皮细胞膜上活性明显降低(图3)。

图3 DK组Ⅰ型肺泡上皮细胞ALP组化结果 ×10 000

3 讨 论

近年来国内外多项研究均证实肺是糖尿病损伤的靶器官[18]。糖尿病对肺的影响主要以微血管病变引起的肺间质损害为主[3]，表现为:终末糖基化产物增多，细胞间基质增生;糖尿病肺微血管病变出现基底膜增厚、透明性变，血管壁硬化和管腔阻塞，肺泡上皮增厚，肺泡隔透明性变和硬化，肺泡腔内积聚巨噬细胞和代谢产物，气-血屏障增厚等改变;28周糖尿病大鼠肺上皮细胞和毛细血管基底膜不同程度增厚，肺泡巨噬细胞伪足减少，肺泡数目增多[19];糖尿病大鼠早期肺即发生形态学变化[20]，DKA病人CT扫描可见肺水肿[21]，甚至出现 ARDS[11]危及生命。我们观察到DKA家兔Ⅰ型肺泡上皮细胞存在基底膜增厚、细胞膜表面模糊、细胞外有高电子密度的无定形物等改变，在血窦可见红细胞、粒细胞黏附于血管内皮细胞上，气-血屏障显著增厚等变化，说明DKA时存在明显的Ⅰ型肺泡上皮细胞结构损伤。

ALP为细胞膜上参与物质转运的酶，该酶活性的强弱和分布的状况反映了细胞膜的转运功能，ALP细胞组化染色可以观察细胞膜上ALP活性变化;其活性与膜转运功能活跃正相关。有些研究者用ALP细胞组化法观察心肌膜损伤[22]。近年来，我们多次用ALP细胞组化法观察肺泡细胞膜的损伤，它是观察组织细胞膜损伤比较好的敏感指标[23-24]，是直接观察和判断细胞膜、细胞器膜性功能变化的直接证据。DKA时机体酸性物质过多，组织的能量代谢障碍，细胞膜的能量供应大幅减少，造成ALP转运功能明显下降。DK组Ⅰ型肺泡上皮ALP活性下降明显，细胞物质转运显著减少，细胞能量代谢出现障碍，使组织损伤加重。

本研究显示，DKA时存在Ⅰ型肺泡上皮结构和功能的损伤，膜性结构的破坏和细胞膜及细胞器膜功能下降起了重要作用。

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