胱硫醚β合酶基因突变对中青年脑梗死再发缺血性血管病的影响☆

刘怀翔谈晓牧刘建国张静张哲成

·论 著·

胱硫醚β合酶基因突变对中青年脑梗死再发缺血性血管病的影响☆

刘怀翔*谈晓牧△刘建国※张静⊙张哲成⊙

目的 前瞻性研究观察胱硫醚β合酶（cystathionine β synthase CBS）T833C基因突变对中青年脑梗死患者再发缺血性血管病（脑梗死、TIA、心肌梗死、其他血管栓塞）的影响。方法 分别采用高压液相色谱法和扩增阻滞突变体系法检测152例中青年脑梗死患者和84例正常对照组的血浆总同型半胱氨酸 （total homocystine tHcy）水平和CBS T833C基因型，在5年内对其随访追踪再发缺血性血管病的情况。结果 CBS T833C基因C／C纯合突变型、C／T杂合型和T／T野生型中青年脑梗死患者随访再发脑梗死的再发率C／C型（35.00%）依次高于C／T型（22.00%）和T／T型（13.41%）；各基因型随访发生TIA、心肌梗死和其它血管栓塞，趋势是C／C型高于C／T和T／T型，C／T高于T／T型；不同基因型随访总的缺血性事件有显著性统计学差别（P＜0.01），发生率分别为C／C型（60.00%）、C／T型（40.00%）和T／T型（23.17%）；Logistic回归分析显示tHcy水平升高是中青年脑梗塞再发缺血性血管病的独立危险因素（OR为1.110；95%CI：0.989～1.245，P＜0.05），而CBS T833C基因突变未进入回归模型。结论 血浆tHcy水平升高是中青年脑梗死再发缺血性血管病的独立危险因素，CBS T833C基因突变引起tHcy水平升高，可能是间接导致中青年脑梗死再发缺血性血管病的易感基因。

胱硫醚β合酶 脑梗死 同型半胱氨酸 中青年 再发

Bos MJ等［1］研究已发现高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia，Hhcy）是青年缺血性卒中或TIA复发血管事件的危险因素，胱硫醚β合酶（cystathionine β synthase CBS）是同型半胱氨酸（homocystine，Hcy）在体内代谢过程中的一个关键酶，本研究结合目前同类研究现状和不足，对中青年脑梗死患者进行了tHcy水平及CBS基因型检测，并对其在5年内进行再发缺血性血管事件的随访，以期为临床防治中青年脑梗死再发缺血性血管病提供新的证据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 根据1996年全国脑血管病会议诊断标准［2］，选取2000年至2003年住院的中青年脑梗死患者185例（随访152例，失访33例），随访患者中，男113例，女39例，29～55岁，平均年龄（49.38±5.45），除外房颤和肝、肾、甲状腺疾病及服用叶酸与B族维生素制剂的患者，于发病后5年内对患者进行跟踪随访，以了解再发缺血性血管病的情况（随访方式包括门诊、电话和信件联系），随访期间均予以患者常规阿司匹林治疗，高血压、糖尿病、高血脂等均以药物进行控制干预。同期健康对照组90例（随访84例，失访6例），随访对象中男59例，女25例，平均年龄（48.32±5.20）岁，既往身体健康，年龄、性别构成、吸烟及饮酒状况同病例组相匹配。

1.2 研究方法

1.2.1 血样采集与检测 受试者（病例组均发病3 d内）当日晨空腹静脉血8 mL，2 mL以5%EDTA抗凝，冰浴，1 h内离心取血浆于－70℃冰箱保存，用于待测血浆tHcy水平，另外6 mL用于肝、肾功能、血脂等常规生化指标检查。使用Waters-600E高效液相色谱分析仪及 RF-10A荧光检测仪和CR-1B色谱数据处理机、Eorbax×C18（250 mm× 4.6 mm）分析柱进行血浆tHcy测定；余生化指标测定由TBA-120FR全自动生化分析仪完成。

1.2.2 CBS基因型多态性检测 采用扩增阻滞突变体系法（PCR-ARMS）分析CBS T833C基因型，取肘正中静脉血2 mL，5%EDTA抗凝。用TKM法提取基因组DNA，CBS扩增引物序列参考文献［3］，由上海生物工程公司合成。PCR反应体系50 μL，常规配制，扩增CBS基因的反应条件为：94℃变性5 min，94℃1 min，56℃1 min，72℃1 min，循环30次，72℃延伸7 min。1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物，扩增片段大小为870 bp。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0进行统计学处理，计量资料以±s表示，行t及q检验；计数资料用χ2检验；中青年脑梗死再发危险因素采用逐步Logistic回归分析方法处理。检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 两组tHcy水平、Hhcy检出率及一般情况病例组tHcy水平及Hhcy检出率明显高于对照组（P＜0.01）；病例组高血压、糖尿病、冠心病、Glu、TC、TG、LDL和体重指数（BMI）均高于对照组（P＜0.05）。见表1。

2.2 CBS基因扩增结果和基因型 CBS基因扩增的目的片断长度为870 bp，分为纯和突变型C／C、杂和型C／T及野生型T／T。见图1。

2.3 两组CBS基因型及其等位基因频率分布 病例组CBS基因型及C等位基因频率分布均高于对照组（P＜0.01）。见表2。

2.4 两组CBS不同基因型tHcy水平比较 病例组CBS 3种基因型tHcy水平均高于对照组 （P＜0.01）；病例组中C／C型tHcy水平高于C／T和T／T型者 （P＜0.01），C／T型高于T／T型者 （P＜0.01）；对照组中C／C型tHcy水平高于C／T和T／T型者 （P＜0.05），C／T型与T／T型比较统计学无差别（P＞0.05）（见表3）。

表1 两组tHcy水平、Hhcy检出率及一般情况

图1 CBS基因扩增产物

表2 两组CBS基因型及其等位基因频率分布

表3 两组CBS不同基因型血浆tHcy水平（±s，μmmol／L）

表3 两组CBS不同基因型血浆tHcy水平（±s，μmmol／L）

1）相同基因型中，两组比较，P＜0.012）与同组中，不同基因型比较，P＜0.013）与同组中，不同基因型比较，P＜0.05

tHcy（μmol／L）基因型t C／C①C／T②T／T③F q ①：②①：③②：③病例组35.16±7.60 25.02±6.39 17.02±3.62 106.5461）10.142）18.142）7.802）对照组20.01±1.44 14.39±2.53 13.32±2.22 13.2041）5.633）6.702）1.07 3.3771）7.0231）7.1031）

表4 随访中青年脑梗死患者CBS不同基因型再发缺血性血管事件

2.5 随访中青年脑梗死患者CBS不同基因型再发缺血性血管事件 随访中青年脑梗死患者CBS不同基因型再发脑梗死发生率统计学无差别 （P＞0.05）；各基因型随访发生TIA、心肌梗死和其它血管栓塞的发生率比较，趋势是C／C型者高于C／T和T／T型者，C／T高于T／T型者；不同基因型随访总的缺血性事件发生率有统计学显著性差别（P＜0.01）（见表4）。

2.6 各种危险因素与再发缺血性血管病的关系以0.05、0.10分别作为入选和剔除自变量的显著性水平，将tHcy、CBS基因型、年龄、性别构成、高血压、冠心病和糖尿病患病率、TC、TG、Glu、LDL、HDL、BMI、吸烟率、饮酒率按其作用大小依次引入回归方程。 结果，最终选入回归模型的有tHcy、糖尿病、高血压和TC，其OR值分别为1.110、1.308、2.748和1.810（见表5）。

3 讨论

Boysen等［4］通过对1039名卒中患者空腹血浆tHcy测定以及15个月跟踪调查，发现再发卒中患者血浆tHcy水平高于未再发者，差异具有统计学意义，认为Hhcy是再发卒中的独立危险因素。Pettigrew等［5］在2124名卒中患者的随访过程中发现再发卒中和出现冠脉缺血事件患者的血浆tHcy水平高于其他患者，血浆tHcy每升高1个标准差，卒中再发风险增加1.16倍，冠脉缺血事件发生风险增加1.27倍。本研究Logistic回归分析显示除传统危险因素高血压、糖尿病、TC以外，tHcy升高也是缺血性血管病再发的独立危险因素（P＜0.05），优势比为1.11（95%CI：0.989～1.245），与前述研究观点基本一致。CBS是体内tHcy分解代谢的关键酶，而T833C位点突变是其最常见突变位点［6－7］，可不同程度造成其酶的缺陷而成为Hhcy患者。国外已有研究，CBS基因突变是缺血性脑血管病的危险因素［8］，本研究同样发现病例组CBS基因型及C等位基因频率分布均高于对照组（P＜0.01），提示CBS T833C基因突变可能是中青年脑梗死的遗传危险因素，而CBS T833C基因突变频率可受种族、地域、样本量及病例选入标准等因素影响而不同。CBS缺陷可造成年轻人发生卒中及加速动脉硬化的进程［9－11］，同样可引起静脉栓塞［12］。 本研究对中青年脑梗死患者CBS T833C基因多态性研究分析并经5年随访发现，不同基因型随访总的缺血性事件发生率有统计学显著性差别 （P＜0.01），趋势是C／C型＞C／T型＞T／T型，提示CBS T833C基因突变可能是中青年脑梗死再发缺血事件的遗传危险因素。3种基因型随访再发脑梗死、TIA、心肌梗死和其他血管栓塞事件发生率的趋势是C／C型＞C／T型＞T／T型，因考虑样本例数少，未能行统计学处理，但仍然反映了CBS T833C突变对再发缺血性事件的不良影响，可能延长随访时间和增大样本量会出现显著性差异。但在本研究Logistic回归分析发现CBS T833C基因突变并未进入回归模型，显示其并非再发缺血性血管病独立危险因素，分析其原因可能为CBS T833C基因突变对中青年脑梗死再发缺血性血管病产生的不良影响是通过Hhcy间接实现的，但同时血浆tHcy水平还受到N5、N10－亚甲基四氢叶酸还原酶基因、蛋氨酸合成酶基因及血浆叶酸、维生素水平等多重因素影响，故而CBS T833C基因突变在本研究Logistic回归分析中成为 “干扰因素”被剔除，如对影响血浆tHcy水平的所有因素均进行测定和分析，CBS T833C基因突变可能就会进入Logistic回归模型而成为危险因素。

表5 中青年脑梗死再发缺血性血管病危险因素Logistic回归分析模型

综上，Hhcy可能与中青年脑梗死患者再发缺血性事件密切相关，而CBS T833C基因突变可引起Hhcy，过早地促进了动脉硬化的发生、发展的过程，进而促进了中青年脑梗死患者再发缺血性血管病的发生。在二级预防中，对中青年脑梗死患者，特别是缺少传统危险因素的年轻患者，检测tHcy水平及CBS的基因型是非常有必要且有着积极意义，以便采取干预措施，减少再发缺血性事件的发生。

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（责任编辑：李 立）

The prospective study of cystathionine β synthase gene mutation on the recurrence of ischemic vascular disease in young and adult cerebral infarction.

LIU Huaixiang，TAN Xiaomu，LIU Jianguo，ZHANG Jing，ZHANG Zhecheng.Department of Neurology，the Second Affiliated Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin，300211，China.Tel：022－88328785.

Objective To prospectively observe the effect of cystathionine βsynthase（CBS）T833C gene on the recurrence of ischemic vascular disease（cerebral infarction， TIA， myocardial infarction， other vascular embolism）in young and adult cerebral infarction.Methods The plasma total homocystine levels and CBS T833C genetypes of 152 young and adult cerebral infarction and 84 normal objects were respectively measured by high performance liquid chromatography methods and PCR-ARMS technologies， then we observed the recurrence of ischemic vascular disease within a 5-years follow-up period.Results The difference of recurrent cerebral infarction in CBS T833C C／C homozygous mutant， C／T heterozygous mutant and T／T wild type in patient group within follow-up period，the rate of recurrence was C／C genetype（35.00%）higher by turns than C／T（22.00%）and T／T（13.41%）genetype.The tendency was C／C genetype higher than C／T and T／T genetypes，C／T higher than T／T genetypes in different genetypes follow-up TIA，myocardial infarction and other vascular embolism.There was statistical significance of total ischemic vascular disease events in following up different genetypes（P＜0.01），the rate of recurrence respectively were C／C genetype（60.00%），C／T genetype（40.00%）and T／T genetype（23.17%）.By forward stepwise lo-gistic analysis， we found that the increased tHcy level was a independent risk factor of recurrent ischemic vascular disease（OR＝1.110；95%CI：0.989～1.245，P＜0.05），but CBS T833C gene mutation was not in the regression model.Conclusions The plasma tHcy level increase was a independent risk factor of recurrence ischemic vascular disease in young and adult cerebral infarction， CBS T833C gene mutation caused tHcy level rise and was probably susceptibility gene of recurrent ischemic vascular disease.

Cystathionine βsynthase Cerebral infarction Hhomocystine Young and adult Recurrence

R743.3

A

2010－12－27）

☆ 天津市自然科学基金资助项目（编号：00360411）

* 天津医科大学第二医院神经内科（天津300211）

△ 北京市潞河医院神经内科

※ 北京海军总医院神经内科

⊙ 天津市第三中心医院神经内科

（E-mail：zzc0912＠yahoo.com.cn）