脑星型细胞瘤磁共振波谱与肿瘤细胞的Ki-67、bcl-2相关性研究

苗 红，刘文源，宋福林

（1.抚顺市中心医院影像科，辽宁 抚顺 113006；2.沈阳军区总医院，辽宁 沈阳 110016）

脑星形细胞瘤是最常见的原发性颅脑肿瘤，近年来的研究发现，许多肿瘤不仅存在细胞增殖，同时也存在细胞凋亡受阻，细胞增殖和凋亡的不平衡状态是导致肿瘤恶性生长的基础[1－2]。bcl-2是目前研究较为深入的凋亡抑制基因。Ki-67是目前已知的增殖抗原中最具增殖能力的代表指标。Ki-67和bcl-2的检测对判断星形细胞瘤的恶性程度非常有价值。MR波谱（MR spectroscopy，MRS）是目前唯一无创伤性地研究人体器官、组织代谢、生化改变及化合物定量分析的方法，能在体测量脑组织的各种代谢物。本研究通过对星形细胞瘤1H-MRS的检测与切除肿瘤标本的Ki-67、bcl-2表达情况分析研究，明确两者间的关系，以寻求MRS无创性反映肿瘤恶性程度及预后的可行性的分子生物学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

52例脑星形细胞瘤MRS检查结果与星形细胞瘤标本均来自沈阳军区总医院诊断明确病例，时间从2008年6月～2010年9月，其中男28例，女24例，年龄10～77岁，平均38岁。在得到脑星形细胞瘤波谱图之前，所有患者没有接受化疗和/或放疗，没有脑外伤和/或脑手术史。52例脑星形细胞瘤按照WHO诊断标准分成两组：低级别组（25例）、高级别组（27例）。

1.2 MR检查

使用美国GE 1.5T超导型MRI/MRS扫描系统（Signa，cv/i GE，Milwaukee，Wis.），正交头线圈进行常规T1WI和T2WI扫描。扫描参数：T1WI：TR 300～400ms，TE 10ms；T2WI：TR 3000～4000ms，TE 90～120ms。层厚与层间距1.5mm，FOV 21～24cm，矩阵312×512。T1WI增强的扫描参数与平扫完全一致，对比剂为钆喷替酸葡甲胺 （Gd-DTPA），注射量0.2mmol/kg。

1H-MRS：在平扫完成后即刻进行波谱扫描或在常规检查后2天进行波谱检查。根据病灶特点选择扫描层面即肿瘤最大层面作为MRS定位的层面，感兴趣区（ROI）尽量避开骨骼、脂肪以及含气结构。采用多体素氢质子波谱脑检查 （PROBE/SI proton brain exam/multiple voxel），点分辨波谱（PRESS）序列对肿瘤区、对侧正常脑组织区进行测量，TR 1000ms，TE 144ms，自动匀场，层厚10mm，层距1.5mm，FOV 24×24cm，激发次数（NEX）1，相位矩阵160×160，成像时间260s。

星形细胞瘤化合物相对含量分析：将原始数据传入Sun ADW4.0工作站 （Sun Microsystems，Sauta clara，Clif）利用Functool 2000软件包进行波谱分析，对扫描后波谱进行基线校正，频率翻转等后处理，获得肿瘤以及正常对照脑组织的谱线和各种代谢物分布图（NAA、Cho、Cr、Lac等），并计算出NAA/ Cho、NAA/Cr、Cho/Cr的比值，结果以±s表示，数值测量由两位富有影像诊断经验的医师完成。

1.3 试剂和方法

手术切除获得所有标本经中性4%福尔马林液固定，石蜡包埋，选择典型病灶的石蜡块连续切片，切片厚2μm，HE染色确定病理诊断。免疫组化试剂A：增强液；试剂B：酶标羊抗鼠/兔聚合物，S-P免疫试剂盒，DAB显色试剂盒。一抗Ki－67、bcl-2，DAB显色剂均购于北京中山生物技术有限公司。采用免疫组织化学SP法，按试剂盒说明书进行操作。

1.4 结果判定

bcl-2阳性反应物质主要定位在细胞膜或细胞浆。Ki-67阳性反应物质主要定位细胞核。在组织切片中细胞核或细胞浆呈淡黄色至棕黄色为阳性细胞标志，将阳性细胞数量及显色强度分为3级：阳性（+），阳性细胞数≥25%，强阳性（+++），阳性细胞数≥75%，中度阳性（++），即阳性细胞及显色强度介于强阳性和阳性之间。凡显色强度及背景无明显差别者为阴性。

1.5 统计学方法

将数据归类，利用SPSS 11.5统计分析软件，各组平均值用±s表示，采用χ2检验、t检验和Spersman等级相关分析；Pearson Chi-Square检验。P<0.05为差异有统计意义；P<0.01为有非常显著差异。

2 结果

2.1 1H-MRS结果

对52例肿瘤实体部分、对侧正常脑组织选择测量ROI进行波谱分析（图1～4）。低级别脑星形细胞瘤组、高级别脑星形细胞瘤组和对侧相应正常脑组织代谢物的比值结果见表1。各级别星形细胞瘤的Cho/Cr与NAA/Cho、NAA/Cr与对照正常脑组织相比差异均具有显著统计学意义 （P<0.001），表现为Cho/Cr显著高于对照脑组织，而NAA/Cho、NAA/Cr明显变低。高级别脑星形细胞瘤的Cho/Cr高于低级别脑星形细胞瘤和对照组；而NAA/Cho、NAA/Cr则低于低级别脑星形细胞瘤和对照组（图1～3）。

2.2 免疫组化结果

Table 1 The ratios of metabolite in astrocytoma and corresponding contralateral normal brain

2.2.1 脑星形细胞瘤中Ki-67标记指数免疫组化结果

52例脑星形细胞瘤中 Ki-67阳性表达率为100%（图4，5）。Ki-67表达量随病理级别的升高而增高，低级别脑星形细胞瘤（Ⅰ，Ⅱ级）的Ki-67表达量显著低于高级别脑星形细胞瘤 （Ⅲ，Ⅳ级）（P< 0.01，表2）。肿瘤病理级别（高、低级别）与Ki-67表达量存在正相关（r=0.625）。

2.2.2 脑星形细胞瘤中bcl-2蛋白的表达

在脑星形细胞瘤组织中有bcl-2蛋白表达，其阳性染色部位定位于细胞质内，表现为肿瘤细胞质呈棕黄色（图6，7）。不同恶性度的脑星形细胞瘤的bcl-2蛋白表达不同（χ2=9.283，P=0.007），bcl-2在高级别与低级别脑星形细胞瘤的表达有显著性差异（P<0.001），随着病理分级的升高，bcl-2表达量逐步上升（表3）。

Table 2 Protein expression of Ki-67 in different grade of astrocytoma

Table 3 Protein expression of bcl-2 in different grade of astrocytoma

2.2.3 Ki-67和bcl-2蛋白表达的关系

经Spersman等级相关分析，在52例脑星形细胞瘤中Ki-67与bcl-2蛋白表达密切相关，二者呈明显正相关（r=0.712，P<0.01），见表4。

Table 4 Relationship of Ki-67 and bcl-2 in different grades of astrocytoma

2.2.4 MRS与Ki-67、bcl-2的关系

星形细胞瘤Cho/Cr随Ki-67表达的升高而升高，呈显著正相关 （r=0.809，P<0.01）；星形细胞瘤NAA/Cho与Ki-67表达显著负相关 （r=-0.501，P< 0.01）。星形细胞瘤Cho/Cr随bcl-2表达的升高而升高，呈显著正相关 （r=0.736，P<0.01）；星形细胞瘤NAA/Cho与bcl-2表达呈显著负相关（r=－0.253，P< 0.01）。星形细胞瘤NAA/Cr与Ki-67表达呈负相关（r=-0.416，P<0.01）；星形细胞瘤NAA/Cr与bcl-2表达呈负相关（r=-0.369，P<0.01；表5，6）。

3 讨论

脑星形细胞瘤的1H-MRS表现为NAA/Cho比值降低，NAA/Cr比值降低，Cho/Cr比值升高，出现Lac、Lip峰。本结果显示，不仅低、高级别脑星形细胞瘤分别和对侧正常脑组织的NAA/Cr、Cho/Cr、NAA/ Cho比值存在显著性差异（P<0.01），而且低级别脑星形细胞瘤和高级别脑星形细胞瘤的NAA/Cr、Cho/ Cr、NAA/Cho比值亦存在显著性差异（P<0.05）。脑星形细胞瘤是由异常增生的星形细胞组成，在生长过程中，肿瘤常侵犯正常神经元，从而导致在1H-MRS上NAA明显降低，Cr轻度下降，Cho显著增高，因此NAA/Cr、NAA/Cho比值下降，Cho/Cr比值升高，因此利用NAA/Cr、NAA/Cho、Cho/Cr比值可以区分正常脑组织、低和高级别脑星形细胞瘤，本组与文献报道也大致相同[3-4]。本研究表明，随着肿瘤恶性度的升高，NAA/Cho比值更加降低，各级别间具有显著差异。从表1中可见NAA/Cho低级别脑星形细胞瘤组与高级别脑星形细胞瘤组重叠部分最小，说明NAA/ Cho可以作为脑星形细胞瘤侵袭力与增殖能力的一个综合指标。本研究显示，脑星形细胞瘤的NAA/ Cho、Cho/Cr、NAA/Cr比值与病理级别相关，其中NAA/Cho和Cho/Cr比值反映肿瘤级别比较稳定；随着肿瘤级别的增高，各级别脑星形细胞瘤的NAA/ Cr、NAA/Cho比值存在负相关（P<0.01）；而各级别脑星形细胞瘤的Cho/Cr比值存在正相关 （P<0.01）。Poptani等[5]利用NAA可完全区分肿瘤及炎性病变；在病理组织学分级诊断中，NAA对肿瘤良、恶性鉴别的准确率达到82%，为脑肿瘤分类提供了一种非侵袭性方法。

Table 5 The relationship between the ratios of metabolite in MRS of astrocytoma and the expression of Ki-67

Table 6 The relationship between the ratios of metabolite in MRS of astrocytoma and the expression of bcl-2

Ki-67抗原是存在于增殖细胞核的一种非组蛋白性核蛋白，其表达随细胞周期不同时相而异，与其他反映细胞增殖的指标如细胞增殖核抗原（PCNA）、DNA聚合酶、溴脱氧嘧啶相比，Ki-67抗原半衰期短，细胞脱离增殖周期后迅速降解，更能反映肿瘤的增殖活性、恶性程度及判断患者预后[6-7]。本研究结果显示，Ki-67的表达水平与星形细胞瘤的恶性程度呈正相关，恶性程度较低（Ⅰ、Ⅱ级）的星形细胞瘤与恶性程度较高（Ⅲ、Ⅳ级）的星形细胞瘤之间表达存在显著性差异（P<0.01），与文献报道相似[8]，随着星形细胞瘤恶性程度增加，Ki-67的表达增强。由此可见，Ki-67表达与星形细胞瘤的恶性行为相关，可作为评价星形细胞瘤细胞增殖状态及判断肿瘤预后的重要指标。

bcl-2是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因，bcl-2阻碍细胞凋亡的机制可能在于bcl-2与凋亡促进基因bax拮抗，抑制细胞色素C自线粒体释放至胞质，阻止胞质细胞色素C对caspase蛋白酶的激活，从而抑制凋亡的发生[9]，随着肿瘤恶性程度的增加，肿瘤细胞的增殖和凋亡均会增加，只是细胞凋亡增加相对较少，肿瘤组织的增殖活性和凋亡状态对判断肿瘤的恶性程度、生物学特性具有重要意义。本研究结果表明，脑星形细胞瘤中Ki-67与bcl-2蛋白表达两者之间关系密切 （r=0.712，P< 0.01），bcl-2在各实验组中的表达随Ki-67蛋白表达水平的升高而升高，这表明bcl－2亦有可能作为反映肿瘤细胞增殖能力的指标，其促进肿瘤细胞增殖的原因可能与其抑制凋亡有关。bcl-2与Ki-67联合应用，在低级别脑星形细胞瘤与高级别脑星形细胞瘤的鉴别诊断中会有一定的意义。

本组脑星形细胞瘤的表现为NAA/Cho明显降低、NAA/Cr降低、而Cho/Cr明显升高，NAA/Cho与Ki-67和bcl-2的蛋白表达都是显著的负相关，而Cho/Cr与Ki-67和bcl-2的表达都是显著正相关。当肿瘤细胞的凋亡被抑制、细胞分裂活跃、增殖的肿瘤细胞增多使细胞膜转化增多及肿瘤细胞总数增多，细胞膜磷脂前体增加，使MRS能检测到Cho的升高，另一方面快速增殖的肿瘤细胞破坏了正常的神经元，使磁共振可测得的NAA降低，因此MRS可在一定程度上反映星形细胞瘤的组织学及分子生物学改变。本组病例中并非所有星形细胞瘤的NAA/ Cho、Cho/Cr都与Ki-67和bcl-2的表达一致，个别甚至偏离较多，可能是由于在细胞凋亡抑制和细胞增殖活跃之外还有其他影响因素，对免疫组化指标的检测可更准确反映其恶性程度、侵袭性和预后[10-11]，是星形细胞瘤分级诊断的必要补充。

综上所述，脑星形细胞瘤的MRS（NAA/Cho、 Cho/Cr）比值与Ki-67、bcl-2蛋白表达水平密切相关，MRS基本上与肿瘤的免疫组化表达相一致，MRS可以无创地在活体上全面评价肿瘤代谢信息，对星形细胞瘤诊断、分级、生物学特性评估、指导放疗、术前手术方案制定和判断预后提供分子生物学水平的依据。

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