蜜蜂传染性疾病的实验室诊断技术

任 勤，戴荣国，郭 军，王瑞生，姬聪慧

（重庆市畜牧科学院蜂业研究所，重庆 荣昌 402460）

蜜蜂传染性病害主要包括欧洲幼虫腐臭病、美洲幼虫腐臭病、败血病；囊状幼虫病、麻痹病等；白垩病、黄曲霉病等；螺原体病以及侵袭性疾病中的蜜蜂微孢子虫病、阿米巴病。这些疾病往往是危害养蜂生产的主要疾病。

1 主要诊断方法

1.1 培养镜检诊断方法 此方法主要用于鉴定蜜蜂细菌病、真菌病及原生动物引起的疾病，并且要求病菌在形态和染色上具有明显的特征。在没有细胞系可利用的情况下，培养是不能够利用的。病原培养是诊断的基础和核心，对于不同的病原要加以区分，并且有的病原在培养条件上有严格的要求（如蜜蜂幼虫芽孢杆菌），这就给鉴定带来了一定的难度。Alippi在1995年发明了一种半选择培养基，该培养基含有萘啶酸和吡哌酸，能够在幼虫芽孢杆菌孢子萌发之前抑制大部分芽孢杆菌的生长，为芽孢杆菌的培养提供了依据。Peter E.Lee和B.Furgala在1965年和1967年先后用镜检法对蜜蜂囊状幼虫病进行了检测。有些病原体到目前为止，还没有可行的体外培养方法（如蜜蜂微孢子虫），而且体外培养耗时，不能够规模化进行。

1.2 免疫学诊断方法 免疫学诊断建立在抗原与相应抗体发生可见反应这一原理的基础上，有的反应不可见或难测，可以通过应用补体、溶血以及荧光素、酶和同位素标记等指示物质，使其反应成为可见或可测的状态。血清学方法具有严格的特异性和较高的敏感性，在传染病的诊断、病原微生物的分类和鉴定以及抗原分析、免疫抗体监测等方面，均有较广泛的应用。其优点不仅表现在可利用抗体来诊断未知的抗原或用已知的抗原来诊断未知抗体，还可以进行定量定性分析。血清学诊断方法很多，目前用于蜜蜂传染病诊断的主要有琼脂免疫扩散法、对流免疫电泳法、荧光抗体法（IFA）和酶联免疫吸附法（ELISA）。高纯度抗体的获得是进行血清学诊断的核心问题，目前主要是通过差速离心法获取。

1.2.1 琼脂免疫扩散法 免疫扩散法的原理：抗体和抗原在同一凝胶内扩散，两者相遇后会出现具有一定特征的沉淀带，从而判断抗体是否存在或者抗原性是否一致。Denis L.Anderson对蜂王黑变病病毒（BQCV）、慢性麻痹病毒（CBPV）、克什米尔病毒（KBV）和囊状幼虫病病毒（SBV）利用琼脂免疫扩散法进行了检测，结果证明此方法只有千分之一的敏感性，且特异性不明显。

琼脂本身性质易受温度影响，温度过低，易冻住而变硬失效；温度偏高，则扩散环模糊，误差偏大。琼脂扩散法对加血清的要求严格，首先是加样器，有条件者可选用微量移液管，并且应垂直并完全加入孔中，切勿使样品外溢，否则结果不准确；琼脂扩散法在测量沉淀环直径时，除用米尺外，可改用目镜测微器，其误差小于0.1mm，效果更好。琼脂扩散板在温箱内要保持水平状态，扩散时间不得超过48h，否则沉淀环可能呈椭圆形，不便测量；琼脂扩散法室内重复性不理想；琼脂扩散法是以沉淀环直径与抗原含量的直线关系来绘制标准曲线的，如曲线绘制不精密，误差也会相应增大。

1.2.2 对流免疫电泳法 对流免疫电泳法的原理：抗原在碱性缓冲液中（pH 8.4以上）带负电荷，可由负极向正极移动，而血清中抗体接近等电点，由于电渗作用，可由正极向负极渗透，两者在短时间内相遇后，出现白色沉淀线，根据沉淀线存在与否及沉淀量的多少，可以定量检测出样品中抗原或抗体的存在及含量。根据出现沉淀线和抗原稀释倍数最高一孔的稀释度，可以测定出被测血清的效价和应用价值。

本法由于电场的作用，限制了抗原、抗体的自由扩散，使其定向泳动，因而增加了试验的灵敏度，并缩短反应时间。此法操作简便，仅需30～60min，灵敏度比双向琼脂扩散高10～15倍，但缺点是特异性不如双向琼脂扩散高。

1.2.3 荧光抗体法 荧光抗体法的原理是利用异硫氰荧光素与抗体或者抗原生成复合物，以此测定抗体或者抗原的一种方法。荧光标记抗体与相应的抗原结合后，在荧光显微镜下如果有沉淀产生，则会在沉淀物弧中出现荧光。依据荧光的强度和分布，就能检测抗原的含量和判断抗原是否存在。

荧光抗体技术在临床检验上已用于对细菌、病毒和寄生虫的检验及自身免疫病的诊断等，在细菌学检验中主要用于菌种的鉴定。本法较其他鉴定细菌的血清学方法速度快、操作简单、敏感性高，但在细菌实验诊断中，一般只能作为一种补充手段使用，不能代替常规诊断。

1.2.4 酶联免疫吸附法 酶联免疫吸附法（简称ELISA）始于20世纪70年代，是一种把抗原和抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的检测技术。其基本原理是把抗原或抗体在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体表面，测定时将受检样品（含待测抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应，形成抗原或抗体复合物；反应终止时，固相载体上的酶标抗原或抗体被结合量（免疫复合物）即与标本中待检抗体或抗原的量呈一定比例，经洗涤去除反应液中的其他物质，再加入酶反应底物后，底物就被固相载体上的酶催化变为有色产物，最后通过定性或定量分析有色产物量就可确定样品中待测物质的含量。ELISA法比其他免疫学诊断方法的灵敏度高，特异性强。但也不可避免地存在着一些缺陷，如不能同时分析多种成分，对试剂选择性高，对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应等。

1.3 PCR检测诊断 PCR（聚合酶链式反应）技术是由美国科学家于1983年发明的一种特异基因或克隆序列的体外酶促扩增技术，随后PCR技术迅速发展，各国研究人员也对其进行了不断改进。目前已经有10余种不同类型的PCR技术广泛应用于各个领域。

GOVAN等将PCR技术应用在蜂球囊菌的检测上，结果表明此技术耗时短，特异性较高。LAURO等提出利用套式PCR可直接检测蜂蜜和蜂巢中的幼虫芽孢杆菌孢子，且灵敏度非常高，不仅可以用于美洲幼虫腐臭病的病情预报，还可以用于实时流行病学研究。GRABENSTE INER等对不同地区的囊状幼虫病毒利用逆转录PCR进行检测，获得了一致的检测结果，此方法快速、灵敏，是检测囊状幼虫病病毒的有效方法。WEBSTER等利用特异性PCR引物可以迅速检测到蜜蜂体内的微孢子虫，与传统的显微镜诊断相比,灵敏度大大提高。Elke Genersch建立了RT-PCR检测方法，此方法在检测蜜蜂残翅病病毒上具有良好的呈现性。Elvira Grabensteiner等建立了复合TR-PCR，同时对蜂王黑变病、囊状幼虫病和急性蜜蜂麻痹病进行了检测，进一步提高了检测敏感性和特异性，并且重现性良好。

近年，我国利用PCR技术在蜜蜂疾病的检测上也开始应用。周婷等利用RT-PCR对我国蜜蜂克什米尔病毒（KBV）和急性麻痹病毒（APV）进行了检测，结果表明，到目前为止我国还没有蜜蜂对这两种病毒有感染。许益鹏等利用Nest-PCR对囊状幼虫病病毒进行了检测，结果表明此方法可以在短时间内检测出病毒，可用于对囊状幼虫病的前期诊断。李明等报道，利用RT-PCR可以快速检测出蜜蜂是否感染囊状幼虫病病毒。

PCR技术相对于其他检测方法来说，具有快速、灵敏、耗时短的优势，但其本身也存在一些问题，例如由于各种污染引起的假阳性问题，尤其在病原微生物上表现突出；由仪器、试剂、操作等引起的假阴性问题；另外，由于蜜蜂病原样本的采集存在一定的难度，并且病菌含量小，对检测的灵敏度具有较高的要求。

2 结语

对蜜蜂病害的的防治目前还停留在临床诊断阶段，近几年病害发病率有回升趋势，而且由于临床症状在初期均不典型或者呈隐性感染，容易出现误诊情况，而当出现明显症状时，已经造成经济损失。目前常用的培养镜检诊断由于费时费力，病原的培养条件苛刻，不能大规模进行，在实验室诊断上意义不大。而免疫学反应，由于血清的获取至少也得30d时间，故不能作出快速诊断，另一些血清学检测方法获得的抗原特异性差、敏感性低，容易和其他病原存在抗原性交叉，产生假阳性，而且不能一次确诊，所以对一些潜在性或隐性传染的疾病诊断价值不大。随着科学技术的进步，蜜蜂疾病的实验室诊断必然会从最初的组织形态学观察向细胞分子诊断水平方向发展。分子技术的发展在诊断蜜蜂疾病上是一次革命，尤其是对蜜蜂病原核酸序列的破译，将会使病原的快速检测、诊断成为可能。

[1]王建鼎，梁 勤，苏 荣.蜜蜂保护学[M].北京：中国农业出版社，1996.

[2]吴 杰.蜜蜂病敌害防治手册[M].北京：中国农业出版社，2002.

[3]曲 芬，成 军.细菌性感染实验室诊断的研究进展[J].临床内科杂志，2003，20（11）：564-556.

[4]金汤东，陈盛禄.我国蜜蜂疾病发生趋势与防治技术[J].中国蜂业，2007，58（2）：23-24.

[5]Elke Genersch.Development of a rapid and sensitive RT-PCR method for the detection of deformed wing virus， a pathogen of the honeybee[J].Veterinary，2005，169：121-123.

[6]曹连飞，李亚辉.PCR技术在蜜蜂疾病诊断中的应用[J].云南农业大学学报，2006，26（6）：794-798.

[7]颜 殉，韩日畴.我国蜜蜂主要病原检测技术[J].昆虫知识，2008，45（3）：483-488.

[8]王 忠，丛艳峰，李玉玲.小鹅瘟血清学和分子生物学诊断方法[J].黑龙江畜牧兽医，2009，（1）：88-89.

[9]周 婷，姚 军.蜜蜂KBV和APV病毒RT-PCR检测技术研究[J].畜牧兽医学报，2004，35（4）：359-462.

[10]李 明，马呜潇，等.辽宁地区中华蜜蜂囊状幼虫病的RT-PCR 检测[J].畜牧兽医科技信息，2008，（12）：25-27.

[11]许益鹏，章奕卿.蜜蜂囊状幼虫病毒病的Nest-PCR检测[J].科技通报，2007，23（6）：824-827.

[12]Yanping Chen，Jay Evans， et al.Horizontal and vertical transmission of viruses in the honeybee[J].Invertebrate Pathology，2006，92：151-159.