髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG抗原肽的制备及免疫原性观察

李 黎,周晴晴,王艳静,闫红霞,石 雨,刘喜龙,康巧珍

(郑州大学生物工程系,郑州 450001)

实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠是研究多发性硬化(MS)的经典动物模型,是由同种型、同种异型、异种型神经组织抗原诱导的中枢神经系统(CNS)白质免疫炎性脱髓鞘性疾病模型。制备EAE动物模型的方法多种多样,其中利用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)制备C57BL/6小鼠EAE模型是研究MS免疫发病机制的理想模型。C57BL/6小鼠对 MOG的敏感抗原表位是 35～55位氨基酸[1]。MOG35～55抗原肽含 21个氨基酸,分子量为2582.4道尔顿。鉴于固相合成法在合成小分子多肽方面具有快速、简便、高效等优点,2010年 9～12月,本研究选用该方法并加以改进,用以制备MOG35～55抗原肽,并以合成的多肽免疫 C57BL/6小鼠,观察其免疫原性。

1 材料与方法

1.1 实验动物、仪器、试剂 雌性C57BL/6小鼠16只,8～10周,体质量 16～18 g。高效液相色谱仪,冻干机,多肽合成仪,质谱仪。Fmoc-氨基酸,DIC, HOBt,DMAP,Wang树脂,茚三酮,哌啶,吡啶,TFA, DCM,DMF,乙腈,苯酚,KCN,无水乙醇,完全弗氏佐剂(CFA),百日咳毒素(PTX)等。

1.2 方法

1.2.1 MOG35～55的合成 采用改进的Fmoc固相法。鼠源 MOG35～55多肽含 21个氨基酸,序列为MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK。①肽链合成：采用Wang树脂[3]作为固相载体,取代值为 1.51 mmol /g。取Wang树脂0.25 g,置于多肽合成仪中,加入DMF溶胀20min,将要连接的第1个氨基酸Fmoc-Lys-OH及HOBt用少量DMF溶解,加入合成仪中,再加入DIC,混匀后置摇床振荡10min,然后加入DMAP,置摇床反应2.5 h;依次用DMF、MeOH、DCM、DMF洗涤(DMF2次,MeOH、DCM各3次,每次2 min);在接肽反应之前用含20%哌啶的DMF溶液脱保护液(20 min,2次),然后加入下一个氨基酸进行缩合。成肽反应使用缩合剂为HoBt、DIC的混合液,反应时间约 3 h。如此重复脱保护、缩合的过程依次由羧基端向氨基端方向延伸至肽链组装完毕。在每一步缩合反应后以茚检试剂(5%茚三酮乙醇液、80%苯酚乙醇和含2%KCN的吡啶溶液的混合液)检测呈阴性(溶液为亮黄色,树脂无蓝点)即可进行下一步脱保护。②肽树脂的切割：切割试剂(TFA、三蒸水、苯甲硫醚、1,2-二硫醇、苯酚,其用量依次为4.95、0.3、0.3、0.15、0.3 m l)配置好放入冰箱中冷冻后加入肽树脂,室温下磁力搅拌 3 h左右,然后过滤到冰乙醚中,离心,收集沉淀,冻干,即得到多肽粗品。③产物纯化：使用反相高效液相法进行纯化分析,色谱柱为C18柱;流动相A为0.1%三氟乙酸(TFA)的超纯水溶液,流动相B为0.1% TFA的乙腈溶液;梯度洗脱(以B液浓度为基准)共50min,其中B液25%～70%用时40min,B液70%～70%用时5 min,B液70%～25%用时5 min;检测波长228 nm。最终用激光解析质谱鉴定多肽,用数据分析软件分析合成多肽的分子量。

1.2.2 EAE的诱导 C57BL/6小鼠随机分为EAE组和正常组,各 8只。MOG35～55多肽用 PBS稀释后与CFA(结核杆菌的终浓度为4mg/ml)按等体积混合,用注射器反复抽吸成油包水的乳剂。EAE组每只小鼠注射0.2m l乳剂,其中MOG35～55多肽剂量为300μg/只,分别于鼠背部两侧皮下注射;在第 1次免疫后0 h和48 h腹腔注射PTX稀释液0.1 m l, 200 ng/只。正常组注射等量生理盐水。

1.2.3 实验鼠体质量检测及神经功能评分 实验鼠自免疫当天开始,每日称体质量,并观察小鼠的摄食情况,从初次免疫至第 31天实验终止前,采用盲法,每天2人至少1次在同一时间按Benson评分标准对EAE的严重性进行临床评估,评分≥2分者为EAE发病。

1.2.4 实验鼠组织取材与病理学观察 在EAE模型发病的高峰期 ,将小鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉后处死 ,迅速取其脑和脊髓,置 4%的多聚甲醛中固定,石蜡包埋后制成6μm厚切片,常规HE染色,镜下观察。

1.3 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件。组间比较用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

成功制备了 MOG35～55抗原肽,精肽产率为13.58%,纯度为95%;其分子量为2 582.0道尔顿,与 MOG35～55的理论分子量 2 852.4道尔顿相一致。

EAE组小鼠从免疫后第 15天开始陆续发病,至第21天8只小鼠均发病。发病后 EAE组小鼠食欲降低、体质量减轻、皮毛不光滑、活动量减少。同时EAE组小鼠相继出现神经系统症状,表现为尾部无力脱垂、步履蹒跚、后肢瘫痪、行动困难,进而发展为四肢瘫痪,Benson评分最高为4分。正常组小鼠未出现神经系统症状,食欲无变化,体质量持续增加,Benson评分为0分。

EAE组小鼠的脑和脊髓实质中均有炎性细胞浸润,病变分布以脊髓颈腰膨大为主,表现为大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润,浸润沿包膜和小血管由外向内延伸,小血管周围可见血管套形成。正常组小鼠脑和脊髓均未见明显异常改变。

3 讨论

MS的典型病理改变是中枢神经系统炎性浸润及脱髓鞘改变。EAE的临床表现和病理改变与MS极为相似,已成为研究 MS的理想动物模型。在EAE的研究中发现,MOG是惟一既能引起脱髓鞘抗体反应又能引起T细胞反应的中枢神经系统髓鞘蛋白成分[4]。虽然 MOG在髓鞘蛋白中含量很少,但由于它存在于髓鞘膜和少突胶质细胞的最外层,故具有高度免疫原性。近年来用MOG诱导的EAE逐渐成为国际上研究 MS的主要模型[5]。

固相合成法在合成多肽中具有快速、简便、高效等优点,但需要对不参与反应的氨基加以保护,同时氨基酸侧链上的活性基团也要给予保护。保护基的选择既要保证侧链基团不参与反应,又要保证在肽链合成过程中不受破坏,同时还要保证在最后肽链裂解时能被除去。本研究参考近年来国内外相关方法,以 Fmoc基团保护α-氨基[6],采用固相合成法合成MOG35～55多肽,并对固相合成法稍作改进(在合成过程中严格控制反应步骤,脱保护后尽快洗涤控制在20min左右、茚检、加入下一个氨基酸;反应时尽量提高反应物浓度,加入最少量的DMF,同时控制摇床温度和速度),合成的 MOG35～55纯度可达95%,精肽产率达13.58%。

本研究中选用的实验动物 C57BL/6纯系小鼠遗传背景明确,MOG多肽的结构明确并可精确定量,在此基础上建立的EAE模型更适合从分子免疫学的角度探讨 EAE的发病机制。特别值得注意的是,本研究以合成的 MOG35～55抗原肽制备 C57BL/6小鼠EAE模型均成功,对后续在某些免疫调节相关基因突变型小鼠中制备EAE模型打下了良好基础。

总之,本研究采用改进的Fmoc固相合成法,可获得具有良好免疫原性的 MOG35～55抗原肽,用以制备的C57BL/6小鼠EAE模型稳定可靠,为进一步研究MS的免疫学发病机制奠定了基础。

[1]Costa O,Divoux D,Ischenko A,et al.Optimization of an animal model ofexperimentalautoimmuneencephalomyelitisachieved with a multipleMOG35～55peptide in C57BL6/J strain ofmice[J].JAutoimmun,2003,20(1)：51-61.

[2]Han X,Gu J.Application ofsolid-phase peptides synthesis[J].Pro Pharmaceut Sci,2004,28(1)：10-13.

[3]郑彦慧,张艳平,张浩,等.Fmoc保护氨基酸与Wang树脂的缩合反应[J].高等学校化学学报,2008,29(9)：1769-1772.

[4]Hjelmstrom P,Juedes TG,Ruddle NH,et al.Cytokines and antibodies in myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental allergic encephalomyelitis[J].Res Immunol,1998,149(9)：794-804.

[5]Adam E,William R,Sergio A,et al.Mice deficient for CCR6 fail to control chronic experimentalautoimmune encephalomyelitis[J].J Neuroimmunol,2009,213(1-2)：91-99.

[6]Chen X,Luo SL,Zhang B,et al.Developmentofsolid-phase polypeptide Synthesis[J].Biotechnology,2006,16(1)：81-82.