棉花蛋白提取方法及其蛋白质组学研究进展

林必博

（杨凌职业技术学院，陕西 杨凌 712100）

蛋白质组是指由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的学科，其主要研究技术双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）可在同一张凝胶上分离上千种蛋白质，具有大规模、高通量的特点[1]。蛋白质组学研究不仅可以分析有机体内基因组所表达的整套蛋白质，而且可提供大量有机体在各种生理状态下蛋白质动态变化的信息，深入揭示有机体代谢调控的本质。棉花（Gossypum hirsutum L.）是最有经济价值的纤维作物，也是重要的油料植物[2]，其研究一直以来受到广泛关注。

本文主要介绍了棉花蛋白质组学研究中，用于蛋白质样品提取的2-DE方法以及棉花蛋白质组学的研究进展。

1 棉花蛋白质样品提取方法

在蛋白质组学研究中，蛋白质样品的质量好坏决定于2-DE是否能获得高分辨率的凝胶图谱和后续分析的准确性。通常来讲，所取材料的成分越复杂，蛋白质样品的制备越困难。棉花组织特别是研究的重点对象棉纤维和胚珠，是一种典型的顽拗性植物组织，含有多糖、酚类复合物、脂类、萜类以及大量的次级代谢物。因此，如何从棉花组织中提取高质量的蛋白质样品用于蛋白质组学研究显得尤为关键。Graves等[3]采用水法对棉花胚和纤维中的总蛋白进行了提取。林金科等[4]则采用尿素法进行了棉花蛋白质的提取，但2-DE凝胶图谱效果并不理想。徐子剑等[5]的研究也证明了2-DE凝胶图谱效果并不理想。目前，棉花蛋白质组学研究中蛋白质样品的提取，主要参考常用于植物组织总蛋白质提取的三氯乙酸/丙酮沉淀法[6]和酚抽提法[7]。

1.1 三氯乙酸/丙酮沉淀法

三氯乙酸/丙酮沉淀法的要点：在二硫键还原剂二硫苏糖醇（DTT）或β-巯基乙醇存在的情况下，采用含10%三氯乙酸（TCA）的丙酮溶液反复对液氮研磨后的组织样品进行沉淀。操作步骤[8]：（1）在液氮中将胚珠研磨成粉末，悬浮于至少5倍体积的含10%TCA和0.07%β-巯基乙醇的丙酮中（－20℃预冷），充分振荡混匀，－20℃静置 2 h 以上；（2）40000g，4 ℃离心 15 min，弃上清，将沉淀悬浮于－20℃的0.07%β-巯基乙醇的丙酮中，充分振荡；（3）40000g，4 ℃离心15 min，弃上清；（4）将步骤（2），（3）重复 3 次；（5）将沉淀真空冷冻干燥，得到粗蛋白干粉。

1.2 酚抽提法

酚抽提法的要点：在二硫键还原剂二硫苏糖醇（DTT）或β-巯基乙醇存在的情况下，采用Tris-HCl（pH值为8.65）提取缓冲液对液氮研磨的组织样品粉末进行蛋白质抽提，然后加入This-HCl（pH值为8.0）饱和酚，在室温下振荡使蛋白质分布于酚相，而后用乙酸铵甲醇溶液从酚相中进行蛋白质沉淀。主要操作步骤[9]：（1）植物组织用液氮研磨至粉末，加入3倍体积的提取缓冲液（500mmol/L Tris-HCl（pH 值为 8.65），50mmol/L EDTA，100mmol/L KCl，2 mmol/L DTT）和3倍体积This-HCl（pH值为8.0）饱和酚匀浆 1 min；（2）12000 g，20℃离心 10min，收集酚相以及界面，丢弃水相与沉淀；（3）酚相加入10倍体积含0.1 mmol/LNH4Ac的预冷甲醇溶液，-20℃过夜；（4）离心，沉淀悬浮于含0.1 mmol/L NH4Ac的冷甲醇，洗涤3次，冷丙酮洗涤1次；（5）将沉淀真空冷冻干燥，得到粗蛋白干粉。

1.3 三氯乙酸/丙酮沉淀法和酚抽提法提取效果的对比

从2种方法的操作程序比较来看，酚抽提法较三氯乙酸/丙酮沉淀法使用了相对较多的药品和试剂，需要更长的时间，且酚具有较大的毒性和腐蚀性。刘康等[9]分别用这2种方法提取棉花胚珠和纤维总蛋白质，用三氯乙酸/丙酮沉淀法提取得到的蛋白质获得率为2.3 mg/g，双向电泳后，用胶体考马斯亮蓝染色法染色后检测的蛋白质点数极少；银染色后蛋白质点数没有明显的增加。而用酚抽提法得到的蛋白质获得率达到10.4 mg/g，是三氯乙酸/丙酮沉淀法的近5倍，双向电泳后，用胶体考马斯亮蓝染色法染色后检测的蛋白质点数可以达到923个；银染色可以检测到1061 个蛋白质点。蛋白质点在凝胶图谱上pH值3～10的范围均有分布，但主要集中在pH值4.3～8.6范围。这表明酚抽提法获得的蛋白质种类较多，pI分布范围较宽，蛋白质容易溶解。赖童飞等[8]以棉花初生壁形成期的胚珠为材料，通过蛋白质产率、纯度测定以及凝胶电泳图谱上蛋白质点的数量对三氯乙酸/丙酮沉淀法和酚抽提法进行了比较分析，结果显示，酚抽提法获得的蛋白产率高、质量好、种类多。可见，酚抽提法比三氯乙酸/丙酮沉淀法能取得更好的效果。

进一步分析发现，三氯乙酸/丙酮沉淀法可有效抑制蛋白水解酶和修饰酶活性，但对高分子量蛋白质溶解性较差，难于沉淀低分子量蛋白质，造成了损失，同时一些可溶性多糖和酚类多聚体杂质也被提取，因此，提取的蛋白质样品产率低，且含有较多的杂质；而酚抽提法中，This-HCl（pH值为8.0）饱和酚对蛋白质有很强的溶解能力，使核酸和可溶性多糖分散于水相中[10]，且可以有效减少蛋白质分子与其他分子间的相互作用[11]，所提取的蛋白质样品不仅产率高，而且具有较好的纯度。

尽管现有资料均表明，酚抽提法比三氯乙酸/丙酮沉淀法在蛋白质提取方面具有优势，且这2种方法所提取的蛋白质在种类上存在一定差异。研究发现，酚抽提法能更有效地对酸性区域以及高分子量和低分子量蛋白进行提取[8]，分析其原因是酚抽提法远离了酸性环境，提高了对占总数蛋白半数以上的酸性蛋白的溶解度；而三氯乙酸/丙酮沉淀法对高分子量蛋白质溶解性较差和难以沉淀低分子量蛋白质的性质，决定了这2类蛋白质的丢失，这是2种方法所提取蛋白质在种类上存在差异的主要原因。以向日葵等其他植物为材料，对这2种方法提取效果的比较研究也得到了类似的结果[12-14]。

Yao等[15]通过对酚抽提法进行改良，发现在提取过程中，添加交联聚维酮（PVPP）和十二烷基硫酸钠（SDS），可获得更高的蛋白质产率，且蛋白质溶解性和凝胶上蛋白质点的亮度有所提高。

综上所述，酚抽提法较适合于棉花组织蛋白质样品的提取。但考虑到酚抽提法和三氯乙酸/丙酮沉淀法所提取蛋白质在种类上的差异，在实际使用中这二者应根据需要相互配合，以便取得更加全面的蛋白质表达信息。此外，值得注意的是，由于棉花组织之间的差异，这2种方法可能有不同的效果，但目前尚未见相关报道。

2 棉花蛋白质组学研究进展

目前，棉花蛋白质组学的研究依然处于探索阶段，现有的报道主要集中在棉纤维的发育过程和抗逆性方面。

2.1 棉花发育蛋白质组学分析

采用蛋白质组学研究，可深入分析与发育相关蛋白质表达的变化，有助于进一步揭示棉纤维发育的调控机理。早在1988年，Graves等[3]就探索利用2-DE来研究棉花胚珠和纤维蛋白质，根据-6～20DPA蛋白质表达谱的动态变化，确定了-3 DPA是纤维起始发育的开始。随后，Turley等[16]在离体培养条件下产生纤维的胚珠中，通过2-DE发现了5个特异表达的蛋白质。但这些研究中，2-DE分离效果并不理想。Ferguson等[7]比较了14 DPA和21 DPA这2个发育阶段棉花纤维的蛋白质2-DE图谱，发现了45个差异表达的蛋白质点，对2个表达差异比较大的蛋白质点进行N-末端氨基酸测序，其中1个被鉴定为细胞质苹果酸脱氢酶，但由于未进行差异表达蛋白质的全面质谱鉴定，因此，缺少进一步的信息。

王娟等[17]以陆地棉徐州142为材料，比较了棉花纤维伸长及初生壁形成期（10DPA）和次生壁增厚期（25 DPA）蛋白质组的变化，采用MALDI-TOF-MS鉴定了15个差异表达的蛋白质点，并对5种差异蛋白质进行了半定量RT-PCR分析。结果表明，这些差异表达蛋白质分别属于F-box家族蛋白、肌动蛋白、β-微管蛋白、F1-ATP合成酶、ATP酶β亚基、膜联蛋白、磷酸甘油酸酯激酶I、胞质苹果酸脱氢酶、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶、谷氨酰胺合成酶、Cu-Zn超氧化物歧化酶、profilin、4-香豆酸辅酶A连接酶等，反映了棉纤维发育初生壁形成期至次生壁增厚期，与能量代谢、碳代谢、细胞周期调控和发育等相关蛋白质的差异表达，其不足之处是仅分析了2个阶段。Yang等[18]则进行了更为全面的研究，对5～25 DPA棉花胚珠和纤维发育5个典型阶段的蛋白质表达谱进行了详细比较，鉴定了106个差异表达蛋白质。分析表明，这些蛋白质参与能量和碳水化合物代谢、蛋白质转运、细胞应答、氧化还原动态平衡等涉及到棉纤维发育的细胞和代谢调控过程，进而揭示了这些蛋白质的变化与纤维发育的可能关系，为棉纤维发育过程中相关蛋白质的功能研究提供了框架。

2.2 棉花抗逆境差异蛋白质组学分析

目前，已经从多方面进行了抗逆性研究，但应用蛋白质组学的研究鲜有报道。李锐等[19]通过2-DE和质谱技术，对低温前后不同抗冷级别的棉花品种锦3047和410的蛋白质组进行了比较分析，在抗冷性较强的锦3047中发现50个蛋白质点在低温胁迫前后的表达量有明显差异，其中有19个丰度值变大，绝对丰度明显高于抗冷性较弱的410；11个丰度值变小，绝对丰度低于410；锦3047特有8个蛋白质点表达量上升，而在410中几乎不表达。通过质谱分析了其中30个蛋白质点，发现逆境蛋白占20%，这些蛋白可能与锦3047的抗冷性具有密切关系。

王雪等[20]以陆地棉低酚棉品种豫无620为材料，在接种黄萎病菌后24，48，72 h提取叶片蛋白质，采用2-DE技术研究棉花在黄萎病菌胁迫条件下叶片蛋白质组的变化。结果表明，棉苗在黄萎病菌胁迫下，3个时间的叶片蛋白质图谱与未接种对照组均存在显著差异，病菌胁迫下的棉苗叶片被诱导产生大量新的蛋白质，而且在3个时间均出现了3个差异表达蛋白质点，其通过MALDI-TOF-MS分析和数据库检索，分别鉴定为DEAD/H boxRNAhelicase、丝氨酸蛋白酶抑制剂和ODR-3蛋白，推测这些蛋白可能在棉花对黄萎病的抗性反应中发挥作用。

3 展望

与国际棉花生产相比，我国皮棉总产量居世界第一，但棉纤维品质较差[21]。通过蛋白质组学研究，结合基因组学、功能基因组学、生物信息学等，将有助于全面揭示棉纤维的发育机理和品质形成的遗传基础，为我国棉纤维品质的改良提供理论依据。抗逆性是棉花研究的重要方面，进一步扩展和深入研究蛋白质组学对棉花的抗逆性，有助于揭示棉花的抗逆机理，为其新品种的选育提供重要的参考依据。

亚细胞蛋白质组是蛋白质组学中的新生力量，分析某一亚细胞结构的蛋白质组成，不仅可降低样品复杂度，使分析简单化，而且还可富集亚细胞的低丰度蛋白，具有重要的研究意义[22]。但目前棉花的蛋白质组学研究仅包括棉纤维、胚珠、子叶、叶片等，有待于深入到亚细胞水平。有关棉花的蛋白质组学研究不管是广度还是深度，仍处于探索阶段，大规模、系统化的研究还相对匮乏。相信随着研究工作的开展，蛋白质组学研究在棉花中的应用将会更加深入广泛，为棉花的品质改良等研究提供大量信息。

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