附红细胞体病的病原学及诊断方法研究进展

2011-04-13吕成林苏秀华崔月荣张衍俊山东省嘉祥县畜牧兽医局272400

山东畜牧兽医 2011年8期

吕成林苏秀华崔月荣张衍俊（山东省嘉祥县畜牧兽医局 272400）

附红细胞体病的病原学及诊断方法研究进展

吕成林苏秀华崔月荣张衍俊（山东省嘉祥县畜牧兽医局 272400）

附红细胞体病(简称附红体病)是由血液寄生生物—附红细胞体(Eperythrozoon)寄生于红细胞表面或游离于红细胞内、血浆、组织液及脑脊液中引起，以发热、溶血性贫血和黄疸为主要特征的人畜共患病[1]。该病不仅能造成畜禽生产性能下降，还能导致动物死亡，同时还危害着人类身体健康。因此，自20世纪80年代以来，国内外学者对附红细胞体病进行了较为深入的研究。

1 猪附红细胞体病的现状

附红细胞体感染早在上世纪20年代就被人们发现。1928年Schilling和Dinger同时在啮齿动物体内发现了类球状血虫体。不久，Bartno在啮齿动物的红细胞内和红细胞表面上发现二分裂菌体。1934年Neitz等在绵羊的红细胞上或在其周围发现有多形态的微生物，并命名为绵羊附红细胞体。同年Adler等在牛体内发现了形态与球状血虫体相似的微生物，命名为温氏血虫体。与此同时儿Kinsely等揭示了猪的类边虫科微生物所引起的疾病就是附红细胞体病[2,3]。1950年splittec证实附红细胞体是引起猪黄疽性贫血的病因，并命名为猪附红细胞体[3]。

自80年代后，国内外对附红细胞体感染人及动物发病的研究越来越多[4]。1986年Puntarie等正式描述了人的附红细胞体病。在国内，晋希民首先在病兔中发现兔的附红细胞体，以后许耀成等[5]在江苏发现猪附红细胞体，华修国[6]在上海首次发现犬的附红细胞体病。1982年崔君兆等曾在人体内发现一种基本特征类似附红细胞体的微生物，而1983年张汝勇等在5份人血液中就查到了附红细胞体。随着现代畜牧业的高速发展，动物饲养密度的增加为传染性疾病的控制增加，从90年代末期开始有关本病报道日渐增多。至今，我国已有22个省、市、自治区有该病报道。资料显示，本病己发生于人及绵羊、山羊、马、骡、驴、骆驼、牛、猪、犬、猫、兔、狐、貉、水貂、鼠、鸡等多种动物，其中猪发病的报道占绝大多数[4]。

猪的附红细胞体不仅导致畜产品质量和产量的降低，还导致怀孕母猪出现受孕率下降或发生流产、死胎等现象。更严重的是感染了附红细胞体病的猪免疫机能大大下降，为其它病原体的传入打开了通道，很多猪场因此损失惨重，所以目前猪的附红细胞体病已越来越引起我国养猪者的重视[7]。

附红细胞体的传播之广及其对畜牧业所造成的危害之大，已开始受到各国畜牧兽医界、外贸界的严重关注，同时这种人兽共患传染性疾病对人体的危害也正受到医学界的注意。附红细胞体病为全国性分布和全球性分布，遍及全世界，包括南北美洲，非洲，欧洲和亚洲[8]，目前世界各大洲的30多个国家和地区均有发生和流行。

2 病原体及生物学特性

附红细胞体无细胞壁，由单层界膜包裹着，无明显细胞器和细胞核，多数为球形、卵圆形、环行、杆状等形态生物体，直径为0.2~2.6μm，大小不等。起初人们把附红细胞体归属于原虫，后来又把它归属于霉形体目。现《伯杰氏细菌鉴定手册》却又将其单独列为立克次体目(Rickettsiales)无浆体科(Anaplasmataceae)附红细胞体属[9]，然而人们至今仍有学者对此规类持不同的意见。现今已知附红细胞体可分为绵羊附红细胞体(E.Ovis)、山羊附红细胞体(E.lirci)、牛附红细胞体(E.teganodes)、牛温氏附红细胞体(E.wenynoi)、猪附红细胞体(E.suis)、猪小附红细胞体(E.Parvum)、兔附红细胞体(E.lepus)、鼠球状附红细胞体(E.coccoides)、猫附红细胞体病(E.felis)、犬附红细胞体(E.perekropovi)、鸡附红细胞体(E.ga11inae)和人附红细胞体(E.humanus)等14种[10]，不同种的附红细胞体都有相对的特异性，宿主特异性较强，根据宿主不同而分别命名方法的准确性，还有待于进一步研究。

近几年，对病原的基因序列(16SrRNA)分析结果表明，猪附红细胞体不应属于立克次氏体，宜将猪附红细胞体列入柔膜体纲支原体属(MyocPlasma)(Messick等2000；Messick等2001)，据此，Neimark等(2001)认为，应将猪附红胞体改名为猪嗜血性支原体(MycoPlasma hamosuis)[11]。但直到目前，在世界范围内对该病病原体的归属尚未取得统一意见。.

附红细胞体的形态结构有所差异，表现出多样性。在普通光学显微镜和电子显微镜下观察新鲜血片时发现附红细胞体是一种典型的原核生物，是多形态生物体(尚德秋，1994)，有球形、条形、卵圆形、星形、点状、杆状[12~16]，大小为0.2~1.3μm或0.5~2.6μm，无细胞壁，仅有单层界膜，呈点状、杆状。整个结构呈单层膜包被的原盘状[3]，常附着于红细胞表面，有的游离于血浆中左右摇摆，前后爬行，呈翻滚或扭转等多种形式的运动。一个红细胞上一般可附1~15个虫体，其中6~7个多见，被附着的红细胞变成齿轮状、星芒状、菠萝状或不规则形状。还有人报道附红细胞体附于红细胞表面时呈镶角状，称为“镶角红细胞”[17]。猪附红细胞体呈圆形、卵圆形等多种形态，平均直径为0.2~2μm，单独或成链状附着于红细胞体表面，或围绕在整个红细胞上，无鞭毛。附红细胞体在发育过程中，大小和形状也可以发生改变，以往所没有致病力的小附红细胞体实际是猪附红细胞体的未成熟阶段或是前体。

附红细胞体对于干燥和化学药剂抵抗力弱，冻干保存可存活2d[3]，一般常用消毒药均能杀死病原，如在0.5%石炭酸中37℃3h就可以被杀死。加入0.1%的碘酒，可以立即停止运动，不易被碘着色；5%的醋酸溶液中可刺激其运动。陆宙光等[17]人报道不同浓度的革兰氏液使附红细胞体有不同的反应。如向含有附红细胞体血样中加入2倍量的革兰氏液时，附红细胞体附于红细胞表面，不活动；若加入血液半量的革兰氏液，附红细胞体离开红细胞，在血液中作旋转运动。同时他还发现5%碘液和丙种球蛋白对附红细胞体有制动作用，都能使附红细胞体运动停止，且丙种球蛋白还能使附红细胞体凝集成团。但对低温的抵抗力强，侯顺利等人[16]通过把含附红细胞体的抗凝血放入4℃冰箱进行保存试验，发现附红细胞体可存活30d以上。在冰冻凝固的血液中可存活31d，在加了15%甘油的血清中-79℃可保持感染力80d，有报道指出附红细胞体可长期寄居于动物体内，病愈后的动物可终身携带。

3 病原学检查

血涂片染色镜检：附红细胞体血涂片对各类的染色均容易着色[18]。通过姬姆萨染色，红细胞一般呈紫红色，附红细胞体有折光性，外面有白色的环，瑞氏染色时红细胞一般呈淡紫红色，附红细胞体一般呈天蓝色，根据着色深浅，颜色有所改变，每个红细胞上附着的附红细胞体的数目各异，中度感染一般为6~7个；重度感染的时可达到20个以上，此时红细胞暗视野下如同锯齿状，附红细胞体染色的镜检形状与鲜血悬滴的镜检情况相同，但染色时要注意区分附红细胞体与染料沉淀物的区别。

电镜观察：电镜下的红细胞表面的附红细胞体多为球状，饼状，卵圆形，短杆状等多种形态。大小为0.2~2.6nm。单个的附红细胞体则成球状，饼状等多形态[6]。其中，球状附红细胞体上常见有一根到数根细长状结构，附着在红细胞表面上，则使红细胞膜产生一些小而深凹陷的变形。

鲜血悬滴镜检：取静脉血或心血1滴加4~6滴的生理盐水混匀，用盖玻片覆盖。调节光圈至较暗，高倍镜下即可见震颤和变形的血球以及呈淡绿色荧光的附红细胞体。在油镜下可见菠萝样、锯齿状、星芒状红细胞。红细胞内和血浆中可见附红细胞体，大多呈球形、逗号形、条形细小颗粒状[6]。有附红细胞体的红细胞可见明显震颤和小移动。血浆中游离的附红细胞体有明显的翻滚、伸缩、摆动等运动和不同方位的移动。

动物实验：不作常规之用，适用于附红细胞体病研究时使用。以含附红细胞体的红细胞作兔静脉接种4~8d为附红细胞体的高峰期，15d后消失。也有使用鸡、小白鼠为动物模型的[6,12]。

4 血清学检查

用血清学方法不仅可用于诊断，还可以进行流行病学调查和疾病检测。但对附红细胞体的血清学诊断方法国内研究较少，国外研究较多。目前报道的方法有：补体结合试验：1958年Splitter率先用于诊断猪的附红细胞体病。病猪出现症状后的1~7d呈阳性反应，但2~3周后即可转为阴性。该方法用于诊断急性病猪效果较好。但慢性病猪均呈阴性反应[3]。

间接血凝试验：该方法是1975年由Smith研究成功，并将间接血凝试验滴度1:40定为阳性。该法灵敏度较高，能检出补体结合反应转阴后的耐过猪[3]。

荧光抗体技术：该方法是1970年由华松最早用来诊断牛附红细胞体病，抗体在感染后的第4天出现，并随着感染率的上升而上升，第28d达到高峰[3]。

酶联免疫吸附试验：该方法是1976年由Lang等用去掉绵羊红细胞的绵羊附红细胞体抗原进行试验，认为此法的敏感性较间接血凝试验高8倍。1992年HusFrank Hill等对检测猪的附红细胞体与间接血凝实验结果进行比较分析，两者之间差异显著，认为是一种敏感、快速、特异的检测方法。用此法检查诊断附红细胞体病是近几年才发展起来的。张浩等[19]建立起了单抗捕捉ELISA检测猪附红细胞体血清抗体方法，朱凝瑜[20]等建立起了双抗夹心ELISA方法诊断猪的附红细胞体病。

分子生物学诊断：关于附红细胞体病的分子生物学检测和诊断方面主要见于猪附红细胞体，Oberst(1991)在噬菌体gtⅡ构建了猪附红细胞体DNA文库，并筛选出KSU-2克隆作为诊断探针，与感染猪附红细胞体的猪血抽提的DNA杂交反应较好，且不与未感染猪附红细胞体的血所抽提的DNA反应。随后Oberst(1993)又利用PCR一DNA杂交技术分别检测出感染猪附红细胞体病猪血液中的病原体。Gwaltney(1993)用组织原位杂交和电镜相结合对血液样品中的附红细胞体进行了检测，并且建立了利用PCR技术检测猪附红细胞体的技术，最低检测基因组量为450pg，对脾脏切除猪人工感染后24h即可检测出，1994年他又对猪实验性感染猪附红细胞体后血液样品进行了PCR检测和间接血凝试验抗体检测比较，证实PCR方法优于间接血凝试验，且青年猪感染后抗体产生少。Vandervoort(2001)也用PCR技术对牛群中牛附红细胞体的感染进行了检测，结果发现PCR技术比血液涂片敏感性要高得多，甚至可以检测出涂片为阴性的病例。对猪的附红细胞体的分子生物学检测和诊断，不仅为临床上更好的控制该病提供了很好的保障，也为进一步研究该病的发病机制提供了很好的手段，对其他动物的附红细胞体病的研究也是很好的借鉴。根据16SrRNA基因设计引物(Messick JB等，1991)，Brinson等(2001)用于狗附红细胞体检查，Bernet等(1998)用于猫的附红细胞体体检测，目前我国一些学者也用于猪的附红细胞体的检测，如贾杏林[21]等比较了PCR和染色镜检方法对猪附红细胞体病的诊断，这种分子生物学诊断技术特异性和敏感性高，可用于流行病学调查和临床检查。

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