奶牛乳腺炎诊断方法的研究进展

赵玉明 丁守强 （山东省青州市黄楼街道办事处畜牧兽医站 262518）



奶牛乳腺炎诊断方法的研究进展

赵玉明 丁守强 （山东省青州市黄楼街道办事处畜牧兽医站 262518）

奶牛乳腺炎(mastitis)是指奶牛乳腺内由病原微生物感染所引起的炎症反应，是所有奶牛疾病中发病率最高，危害最为严重的一种疾病。根据是否出现临床症状可将乳腺炎分为两种类型：临床型乳腺炎和隐性乳腺炎。前者具有明显的临床症状，容易被发现并及时治疗，后者则因缺乏任何肉眼可见的临床症状，诊断相对困难。目前诊断隐性奶牛乳腺炎的常用方法主要有牛奶体细胞计数(somatic cell counts, SCC)、美国加州乳腺炎诊断试验(California mastitis test, CMT)及乳汁细菌分离鉴定，本文对这些诊断方法的优缺点作一综述。

1 体细胞计数法(SCC)

正常牛奶中的体细胞主要为巨噬细胞，约占体细胞总数的66%~88%，其余为中性粒细胞(约占1~11%)和上皮细胞等。乳腺感染时中性粒细胞数量急剧上升，导致牛奶中体细胞数量显著升高[1]。因此，临床上常以体细胞数量升高作为隐性乳腺炎的诊断指标之一。然而，国际上有关SCC的诊断标准至今仍未完全统一。传统的观念认为牛奶中SCC超过50万个/ml即可诊断为隐性乳腺炎[2]，但也有人认为牛奶中SCC超过20万个/ml[3]或10万个/ml[4]便可诊断为隐性乳腺炎。

当前利用丹麦FOSS公司生产的体细胞计数仪进行牛奶中SCC测定是诊断隐性乳腺炎的常用方法。其基本原理是向牛奶中加入细胞溶解液使牛奶中体细胞破碎而分解出DNA，混入的荧光染料可与DNA结合。经以上处理的牛奶样品通过计数仪的毛细管时被仪器读取相应信息而计算出SCC数值[5]。SCC与牛奶中多种指标存在紧密联系，也可以作为其他方法诊断乳腺炎的参考[6]。虽然SCC法诊断乳腺炎具有快速方便的特点，但由金葡菌引起乳腺炎时SCC值却通常小于20万个/ml。这种情况在奶牛泌乳初期患乳腺炎时表现的尤为明显[7]。另外，在奶牛分娩前后一段时间内牛奶中体细胞数目会发生生理性的变化，分娩后SCC会急剧的上升，50d后又会降低到最小值，在泌乳后期又会缓慢的升高[8]，这些都可影响到SCC方法诊断乳腺炎的准确性。

2 细菌学鉴定

引起奶牛乳腺炎发生的微生物有细菌、病毒、支原体等多达130多种。其中主要病原微生物是金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、乳房链球菌等。通过培养乳汁进行微生物鉴定是诊断乳腺炎的常用方法。利用细菌鉴定诊断乳腺炎的方法不断被完善，如扬州大学孙怀昌等研制出了选择性鉴别不同病原菌的培养基[8]可以方便细菌培养鉴定。但细菌学诊断隐性乳腺炎仍然存在许多局限性。普通培养基对某些病原微生物，如支原体、病毒等无法培养鉴定。另外由于采集奶样的牛场环境微生物丰富，不易保证采集的奶样未受环境污染，故诊断隐性乳腺炎时容易产生假阳性结果，而且细菌鉴定工作量大，至少需要2~3d才能做出鉴定结果。

3 奶样电导率测定

奶牛发生乳腺炎时其奶样中的Na+、K+含量上升，因此可以利用牛奶不同的电导率诊断乳腺炎[9,10]。牛奶pH的变化及乳脂含量的下降也可以影响电导率。已经证实电导率与牛奶中SCC存在密切的关系[11]。对电导性能的测试信号可以转变为计算机信号，故而此法可以实现在线自动检测。电导法检测乳腺炎是目前为数不多的商业化的技术之一。我国已有西南民族学院86-I型隐性乳腺炎诊断仪、西北农业大学XND-A型检奶仪、山西农业大学IRD型乳腺炎电子检测仪。但乳腺炎并非是影响电导率的唯一因素，所以这是用电导法检测乳腺炎的一个缺点。另外牛乳汁电导率数值有个体差异，约14%牛乳汁电导率高于正常值，约26%牛乳汁电导率低于正常值[12]，使该方法的应用受到了限制。

4 PCR诊断方法

Phuektes等[13]建立了一种以16s~23srDNA间隔区为扩增靶序列的多重PCR检测方法。试验测试了117份亚临床感染的乳腺炎奶牛奶样，结果均为阳性，同时证实金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌为主要的乳腺炎病原菌。Riffon等[14]也以16s~23srDNA间隔区为扩增靶序列建立了多重PCR检测方法，检测奶样中引起奶牛乳腺炎的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和副乳房链球菌6种主要病原菌，结果均为阳性，试验表明以16s~23srDNA间隔区为扩增靶序列建立的多重PCR检测方法是一种快速敏感和特异的乳腺炎诊断方法。但该方法受技术操作的限制在基层推广有较大的困难。

5 美国加州乳腺炎检验法(CMT)及其类似方法

该方法的基本原理是用一种阴离子表面活性物质-烷基或烃基硫酸盐，使乳汁中体细胞破裂，释放出其中的核酸，CMT试剂与核酸物质结合产生沉淀或凝胶，细胞中聚合的DNA是CMT产生阳性反应的主要成分，乳汁中体细胞数目越多，则释放DNA越多，产生凝胶也就越多，凝集越紧密。根据这一原理我国兰州(LMT)、北京(BMT)、杭州(HMT)等也研制出了诊断隐性乳腺炎的类似试剂。其它化学检验法还包括过氧化钠法、苛性钠凝乳试验法、氯化钙凝乳试验及氯化物硝酸银试验等。

CMT及其类似剂检测方法可以实现快速的牛旁检测，操作方法简便，适于在生产中推广。但此方法的不足之处是有时遇到可疑病例的情况无法进行最终判定。

6 其他诊断方法

6.1 酶法 Ishikawa和Kitchen[15]研究证实，乳酸脱氢酶(LDH)主要来自被损害的上皮细胞和大量的乳汁白细胞，LDH活性增加反映了白细胞大量聚集的炎症过程和乳腺组织的损害程度。黄利权等[16]研究发现，不同的乳腺炎病原微生物感染乳腺时呈现不同的酶象变化，与阴性感染的乳腺相比，LDH、谷草转氨酶(GOT)等活性均增强。在金黄色葡萄球菌感染时，LDH的活性最高，并且认为LDH在隐性乳腺炎病程中起重要作用。

N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(NAGase)也可以反映乳腺炎发生情况[17]。NAGase是一种细胞内溶酶体酶，炎症发生时由白细胞释放进入奶样。有研究表明，NAGase活性与SCC存在密切的关系，可以精确的反映炎症水平。以NAGase作为参照物进行诊断乳腺炎具有很大的应用前景，目前已有电化学的方法对其进行研究[18]。其他报道的可以作为诊断乳腺炎标志物的酶还有葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase)、过氧化氢酶(CAT)、纤溶酶(Plasmin)等。纤溶酶原在炎症发生时可从血液进入牛奶并转化成纤维蛋白溶酶。后者已经确定与SCC存在联系，但其含量受牛体生理因素和环境因素的影响[19]。赵兴绪等[20]的研究表明，LDH和NAG在不同类型的乳腺炎中，其活性差异都极显著，在分析中表现出了较高的诊断价值。

6.2 急性时相蛋白(APP) 目前研究较多的APP是结合珠蛋白(Hp)和淀粉样蛋白A(SAA)[21]。两者在机体急性炎症发生的时候含量可以上升100倍。Hp是牛的一种主要APP，该物质主要在肝细胞中合成，在不同炎症因子的刺激下合成增加。在正常情况下，牛奶中Hp含量极低以致无法检出，而在乳腺炎症发生过程中，由于血-乳屏障通透性升高，肝脏合成的Hp可通过血-乳屏障而从血液进入到牛奶中。因此，牛奶中Hp含量升高被认为是发生奶牛隐性乳腺炎的特异性标志[22,23]。并且目前已经有针对Hp的光学免疫传感器研制成功[24]。

SAA是一种载脂蛋白，且与奶样中SCC存在密切的联系。有研究表明其可以作为一种诊断乳腺炎的标志物[25]。但Ulrika Grönlunda的研究表明在奶牛牛奶中检测Hp比检测SAA更为容易[26]。

7 结语

奶牛乳腺炎作为奶牛养殖业中的常发病、多发病，每年造成巨大的经济损失。奶牛乳腺炎的发生对牛奶的质量也产生很大影响，病原奶流入市场容易造成公共卫生事件。所以对奶牛乳腺炎的科学防治一直是奶牛场非常重视的一项工作。

目前SCC法、CMT及类方法、病原菌鉴定法是生产中诊断奶牛隐性乳腺炎的主要方法。其中SCC方法需要购买体细胞计数仪，成本较高；CMT及类方法检测成本低、检测速度快，但不能对可疑病例做出准确的诊断；病原菌鉴定法对了解牛场的病原种类、科学防控具有重要意义，但检测周期需2~3d，耗费较大人力物力。PCR方法也是诊断奶牛隐性乳腺炎的一种较可靠的方法。但PCR方法主要停留在实验室诊断中，在生产中用PCR诊断需要一定的专业技术及相关设备，限制了其推广普及。其他的诊断奶牛隐性乳腺炎的方法还有电导率、pH方法，但二者缺乏诊断准确性。另外根据牛奶中相关的酶、APP等在乳腺炎发生时浓度会有所变化，将这些酶或APP作为乳腺炎发生的标志物，进行乳腺炎的诊断亦有很大应用前景。

各种诊断奶牛隐性乳腺炎方法均有不同的侧重点，还没有一种绝对准确的方法。只有结合几种诊断方法并根据奶牛不同的生理状况才能科学诊断乳腺炎。建立诊断成本低、诊断速度快的奶牛隐性乳腺炎确诊方法是一个重要的发展方向。

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（2011–05–16）

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