ROSCO纸片法与ATBFUNGUS3微量稀释法抗真菌药敏试验结果对比分析

段新科，缪应业，刘小圆，郭照静，刘洪强

近年来，真菌感染已成为白血病，淋巴瘤，长期使用免疫抑制、广谱抗生素，中心静脉插管，中性粒细胞减少，血液透析，骨髓或器官移植，机械通气等特殊人群的严重感染性疾病，是医院内感染的重要部分，抗真菌药物的广泛应用导致真菌的耐药率逐年上升，病原性酵母菌的药敏试验已显得极其重要。笔者采用ROSCO纸片法和ATBFUNGUS3微量稀释法，对200株临床分离的酵母菌做药敏测试，探讨其结果的一致性、准确性。现将结果报告如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选择2008-01～06临床各科室送检的血液、痰、中段尿、白带、胸水、腹水等标本所分离到的200株酵母菌。

1.2 方法

1.2.1 标准菌株 白色念珠菌ATCC90028，克柔念珠菌ATCC6258，热带念珠菌ATCC750。

1.2.2 材料 培养基：沙保氏培养基，法国科玛嘉显色培养基，改良SHADOMY琼脂，API20C AUX和ATBFUNGUS3均购自郑州博赛。Rosco药敏纸片：氟康唑（FCZ）、伊曲康唑（ITC）、酮康唑（KTC）、两性霉素 B（AMB）、5-氟胞嘧啶（5-FC）、伏立康唑（VOR）购自广州乐通泰生物科技有限公司。

1.2.3 念珠菌分型 取沙堡氏培养基上已纯化的菌落在科玛嘉 （CHROMAGAR）念珠菌显色培养基平板上画线接种，37℃培养16～24 h，观察结果。根据念珠菌生长菌落在显色培养基上的颜色进行菌种鉴定，绿色—白念珠菌；蓝灰色—热带念珠菌；粉红、白色—克柔或其它念珠菌。其中非白念珠菌全部辅助以API20C AUX生化卡协助鉴定菌种。

1.2.4 药敏试验 Rosco纸片扩散法：接种液浓度为5×105CFU/ml（先配制0.5麦氏浓度，再用生理盐水1∶1稀释），用无菌棉签蘸上接种液均匀涂布于SHADOMY琼脂平皿上，待平皿表面干后，贴上Rosco药敏纸片，并用标准菌株做质控。35℃孵育18～24 h后读取结果，如果生长不足再延长至48 h。ATBFUNGUS3微量稀释法：将菌落混悬无菌盐水中，使其浓度为2麦氏单位，取20 μl加入ATB培养基中混匀。再以微量加样器吸取此菌液加入药敏板中，每孔135 μl，盖上塑料盖，置35℃孵育24～48 h。以生长对照孔生长良好，而含药最高稀释孔不生长者为最小抑菌浓度的终点。

1.2.5 药敏结果判断 根据丹麦Rosco公司制定NeoSensitab抗真菌药纸片法及其判读标准，ATBFUNGUS3说明书进行判读。

1.3 统计学处理 使用SPSS12.0软件进行χ2检验。

2 结 果

2.1 念珠菌属的分布 其中白色念珠菌120株、热带念珠菌37株、光滑念珠菌30株、克柔念珠菌7株、近平滑念珠菌6株。

2.2 药敏结果分析 药敏试验结果都在质控范围内，符合标准。Rosco纸片扩散法与ATBFUNGUS3微量稀释法相符率分别为：FCZ 为 97.22%（175/180）；ITC 为 97.82%（180/184）；KTC 为 97.82%（181/185）；AMB 为 100%（198/198）；5-FC 为96.87%（155/160）；VOR 为 100%（192/192）。 经配对 χ2检验，无显著性差异（P>0.05）。

3 讨 论

念珠菌广泛存在于自然界，并寄生于人体皮肤和黏膜，属于条件致病菌。随着大量广谱抗生素的应用，糖皮质激素的广泛应用，使条件致病真菌的感染呈上升趋势，随着真菌感染发病率的不断上升，真菌病的治疗也面临着严峻的挑战，且有关耐药菌株的报道也逐渐增多。据文献报道：念珠菌血症已占医院获得性血液感染的第四位[1]；另一份报道指出20世纪90年代初和80年代相比，念珠菌病的发生率由每年的每百万分之2.6增至72.8[2]；真菌体外药敏试验也越来越显得重要，这也是临床上用以评价药物敏感性最基本的方法之一。

NCCLS推荐的纸片扩散法操作简便易行，可常规开展，自颁布以来，大量实验室采用此方法检测氟康唑的耐药性，但此法检测药物单一，临床医师迫切需要其它抗真菌药物的体外药敏试验，如伊曲康唑、两性霉素B等，所以实验室需要更适合临床需要的体外抗真菌药敏试验。ATBFUNGUS3是法国生物梅里埃公司的产品，手工操作简便，能检测常用抗真菌药物，只要严格按照规程操作，可得到较为准确的MIC值，但成本相对较高。ROSCO药敏纸片是丹麦ROSCO公司生产的专用于扩散法的纸片，克服了唑类药物扩散性差的缺点，纸片直径9.2 mm，该法操作简便、结果易判读，在国外尤其是欧洲被广泛应用于临床实验室[3]，国内也有实验室采用[4，5]。

笔者选用ATBFUNGUS3和ROSCO纸片扩散法，检测200 株酵母对 FCZ、ITC、KTC、AMB、5-FC、VOR 的耐药性。结果表明，ATBFUNGUS3和ROSCO纸片扩散法相比有较高的符合率，FCZ 为 97.22%（175/180）；ITC 为 97.82%（180/184）；KTC 为 97.82%（181/185）；AMB 为 100%（198/198）；5-FC 为96.87%（155/160）；VOR 为 100%（192/192）。 经配对 χ2检验，两种方法无显著性差异（P>0.05）。

综上所述，Rosco公司的Neo-Sensitab抗真菌药纸片法操作简便、观察时间短、成本低廉，有较高准确性，能及时的为临床提供抗真菌药物相关信息，是值得在临床上推广的一种药敏试验筛选方法；从而为广大实验室选择准确、快速、易于常规开展的抗真菌体外药敏试验提供实验依据。

[1]Groll AH，Shah PM，Mentzel C，et al.Trends in the postmoreten epidemiology of invasive fungel infections at a university hospital[J].J Infect，1996，33（1）:23.

[2]Beck-Sague C，Jarvis WR.Secular trends in the epidemiology of nosocomial fungal infections in the United States 1980-1990.National Nosocomial Surveillance System[J].J Infect Dis，1993，167（5）：1247.

[3]Vandenbossche I，Vaneechoutte M，Vandevenne M，et al.Susceptibility testing of fluconazole by the NCCLS broth macrodilution method，E-test，and disk diffusion for application in the rounte laboratory[J].J Clin Microbiol，2002，40:918.

[4]金 兰，蒋新良，张 嵘.Rosco纸片扩散法检测酵母样真菌对氟康唑药敏试验的评价[J].中华检验医学，2004，27:46.

[5]俞莲花，王冬国，吴大康.72株念珠菌ROSCO纸片扩散法的耐药性分析[J].中国卫生检验杂志，2004，14:92.