食品抗热门货能力检测方法的研究进展

邹 磊，甄少波，宋 杨

(1.中国环境管理干部学院，河北秦皇岛066004;2.中国劳动关系学院，北京100037)

食品抗热门货能力检测方法的研究进展

邹 磊1，甄少波2，宋 杨1

(1.中国环境管理干部学院，河北秦皇岛066004;2.中国劳动关系学院，北京100037)

论述了食品抗氧化能力体内和体外检测的方法。重点介绍了二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)法、ABTS法、硫代巴比妥酸(TBARS)法、Fe3+还原能力(FRAP)法、氧自由基清除能力测定法(ORAC)的机理以及在食品领域中的应用，探讨了食品抗氧化检测方法的相关性和标准化问题，为选择合适的抗氧化方法提供参考。

抗氧化，检测方法，ORAC

癌症与冠心病是世界公认的人类健康杀手。在西方国家，癌症是导致65岁以下人员死亡的最主要原因［1］，每年美国政府花在治疗心血管疾病上的资金高达500～1000亿美元［2］。大量的证据表明细胞代谢或脂类过氧化反应产生的自由基是癌症和冠心病形成的病因［3－4］。抗氧化物质可以阻断自由基侵袭，降低了癌症、冠心病及其他老年疾病的发病风险。食物中抗氧化物质长期以来倍受国内外学者关注，从食物中获取抗氧化物质成为一种健康有效的生活方式，科研人员也相继从食品中发现大量抗氧化物质。食物中抗氧化物质能够保护食物免受氧化损伤而变质，在人体消化道内具有抗氧化作用，防止消化道发生氧化损伤，吸收后可在机体其他组织器官内发挥作用，来源于食物的某些具有抗氧化作用的提取物可以作为治疗药品。如何正确真实地评价食品的抗氧化性成为首要解决的问题，食品抗氧化能力的评价方法随着科学技术的发展和设备的更新而不断地发展和改变。一些过程繁琐、准确性不高的评价方法逐渐被淘汰，下面重点介绍一些近年来出现的食品抗氧化能力评价方法。

1 体外抗氧化能力评价方法

1.1 二苯代苦味酰基自由基法(DPPH·)

195 8年，Blois首次将DPPH·法应用于抗氧化

剂的筛选研究，近年来该方法在抗氧化剂研究中受到普遍重视，它克服了传统方法的一些缺陷，具有快速、简便、灵敏、易检测和直接可行的优点，被广泛用于抗氧化剂的研究［5］。该方法通过测定实验样品对DPPH·的清除能力来反映其抗氧化能力，DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其结构中含有3个苯环，1个氮原子上有1个孤对电子，其甲醇溶液呈深紫色，在517nm有强吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数成化学剂量关系，从而用于评价实验样品的抗氧化能力［6］。Manuel Sandoval等使用DPPH·法评价了十字花科植物玛卡(秘鲁的一种蔬菜，类似中国的长缨萝卜)的抗氧化能力［7］，其清除DPPH自由基的IC50为0.61mg/mL。新加坡学者Leong LP对新加坡当地的27种蔬菜进行了抗氧化能力的测定［8］，表明奇异果(ciku)、萨拉卡(salak)、杨桃(star fruit)、草莓(strawberry)、李子(plum)等具有DPPH·清除能力。国内邹磊等人用清除DPPH·法评价豆豉提取物的抗氧化能力［9］;包斌等人用DPPH·法评价了羊脾脏提取液的抗氧化特性［10］，夏其乐等人做了杨梅汁清除自由基及抑制油脂氧化作用的研究［11］，杨梅汁提取物具备一定的DPPH·清除能力IC50为20.2mg/mL。

1.2 ABTS法(TEAC，Trolox equivalent antioxidant capacity assay)

ABTS法，又名TEAC法。1993年由Miller建立该方法，ABTS法测定总抗氧化能力的原理是，ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS+自由基，在抗氧化物存在时ABTS+自由基的产生会被抑制，在734nm或405nm测定ABTS+自由基的吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力［12］。实验一般使用Trolox用作参考，结果表示为Trolox当量浓度。该方法也是一种普遍使用的测定食品的抗氧化能力的方法。Liu等［13］使用TEAC法评价了荔枝花不同溶剂提取物的抗氧化性;Seeram等［14］评价了美国富含多酚饮料的抗氧化性;Du等人使用TEAC法评价了猕猴桃果实抗氧化性［15］。

1.3 硫代巴比妥酸法(TBARS)

TBARS法是测量脂肪酸，细胞膜和生物组织脂质过氧化的最古老也是应用最多的方法，它还是应用于粗提生物体系最容易的方法［16］，氧化的油脂会生成丙二醛，一分子的丙二醛可同两分子的硫代巴比妥酸(TBA)作用生成有色化合物，该有色化合物在吸光度530nm左右有吸收。因此，可通过测定丙二醛的量来评价油脂的氧化程度。当油脂系统中存在抗氧化物质时，丙二醛的产生就会受到抑制，通过检测丙二醛的抑制程度来说明抗氧化物质的抗氧化能力。Ignasius R A等人使用低密度脂蛋白作为氧化底物，利用TBARS法测定了Mallika和Cikuray品种黑豆种皮的抗氧化能力［17］，测定值分别为37.10、30.37nmol MDA/g低密度脂蛋白，参照物rutin的测定值为30.10nmol MDA/g。Barreira Joao CM等人利用TBARS法测定了栗子各个部分的抗氧化能力，实验中使用猪脑组织作为氧化底物，结果表明栗子皮具有很高的抗氧化能力［18］。

1.4 Fe3+还原能力法(FRAP)

FRAP法原理为在较低pH环境下，Fe3+－三吡啶三吖嗪(tripyridyl－triazine，TPTZ)可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色，并于吸光度593nm处具有最大光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性强弱［19］。Stangeland使用FRAP法测定了35种乌干达本土水果和蔬菜［20］，检测值范围从最高(72.3±13.5)mmol/100g鲜重(孜然芹种子，Syzygium cuminii seed)到最低(0.09±0.05)mmol/100g鲜重(笋瓜，Cucurbita maxima fruit)。郭长江等用FRAP对36种蔬菜、30种水果的抗氧化活性进行了测定比较，并且分析了其抗氧化活性与维生素C含量的关系［21］。

1.5 氧自由基清除能力测定法(ORAC，The oxygen radical absorbance capacity)

目前各国科研人员采用的ORAC方法多是引自Cao 的方法［22］。最早是使用 β－phycoerythrin(β－PE)作为荧光探针，后来改用更为合适的荧光素(Fluorescein，FL)作为荧光探针，反应体系由 FL、AAPH(2，2′－azobis－2－methyl－propanimidamide)、磷酸钾缓冲溶液及抗氧化物构成，静置一段时间后，用紫外、荧光及LC/MS方法同时检测分析反应混合物，记录荧光值。抗氧化剂作用下的荧光衰退曲线下面积与荧光自然衰退曲线下面积的差作为衡量抗氧化剂的抗氧化能力指标，将结果以抗氧化物质Trolox作为标准进行表达。Elisia Ingrid等把ORAC法应用于蓝莓浓缩提取物的抗氧化研究，ORAC值直接和蓝莓的花青素－3－葡萄糖苷的含量呈正相关［23］。Kriengsak Thaipon等使用 ORAC法、ABTS、DPPH、FRAP等方法全面检测了番石榴提取物的抗氧化能力，研究结果表明，番石榴的抗氧化能力在水果中名列前茅［24］。

1.6 快速检测方法

上述检测方法在实验室中进行，需要花费大量时间，检测周期多为2～3h，无法满足大量试样的检测。故国内外开发出了一些抗氧化能力检测试剂盒，方便快捷。试剂盒的原理是基于前述的反应原理。例如碧云天牌总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)、碧云天牌总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)、Zenbio牌 ORAC Antioxidant Assay Kit等。

2 体内抗氧化能力评价方法

体外抗氧化评价方法最大的缺陷就是无法真实模拟体内环境，不能真实反映抗氧化物的实际抗氧化效果。体内抗氧化研究一般都建立一定的动物疾病模型，因为许多疾病会导致体内自由基产生过量，方便于检测抗氧化物的功效。由于动物生命过程体内就会产生自由基，也有不建立动物疾病模型，采用健康个体，采用进食前和进食后进行对比研究。用小鼠作为实验对象，灌胃给予抗氧化物，检测小鼠血浆、肝脏、脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH－PX)、丙二醛(MDA)含量变化。从上述三种酶和MDA的变化状况来判定抗氧化的强度及效果。由于人体不可能直接对肝脏匀浆进行检测，可以测定血液或者尿液中的MDA，以及血液中的SOD、CAT、GXH－PX来判定抗氧化的效果。王建华等研究了枸杞粗多糖在小鼠体内的抗氧化作用［25］，用枸杞粗多糖生理盐水溶液对D－半乳糖的衰老模型小鼠和正常小鼠灌胃。结果表明枸杞粗多糖能较显著(p＜0.01)地提高小鼠血清、肝脏及脑组织中SOD活性，降低MDA含量。Dong Wang等人用豆豉提取物喂食小鼠(胆固醇喂食模型)［26］，结果显示，实验组小鼠肝脏和肾内SOD活性、肝脏内CAT活性和肾内GSH－PX活性得到极显著提高、MDA含量极显著降低(p＜0.05)。Serafini等人研究了绿茶和黑茶对人类的体内抗氧化能力［27］，10人分两组，一组进食茶水，另一组为对照，结果显示进食组的血浆抗氧化能力(TRAP)显著高于对照组。

3 讨论

3.1 不同抗氧化能力检测方法的相关性

有些文献报道指出不同方法检测食品的抗氧化能力，结果显示良好的相关性:Connor等发现测定蓝莓抗氧化能力使用的ORAC法，FRAP法有很高的相关性［28］。Awika发现采用 ORAC 法，ABTS法和DPPH·法检测高粱及其产品的抗氧化能力，方法有很高的相关性［29］。Kriengsak Thaipong在对番石榴的抗氧化研究中发现ABTS法，DPPH·法，FRA法和ORAC 法相关性很好［24］，相关系数在 0.68～0.97。然而食品成分非常复杂，各抗氧化物质的抗氧化作用无法用单一的机制解释。不少文献报道也指出各个方法之间没有太大的相关性，甚至用某法检测某食品具有抗氧化能力，而使用另一方法检测却没有抗氧化能力。李华等人利用数学统计方法对抗氧化检测方法的相关性研究发现:ABTS法和FRAP方法相关性最高，相关系数仅为0.6775。而金属螯合检测方法和其他方法相关性最差［30］。

另外由于测定样品的不同，不同测定方法间的相关性明显不一致，例如:Ou等人在测定不同蔬菜的抗氧化能力时，ORAC法和FRAP法的相关系数为0.0055、0.96、0.13、0.78、0.15、0.64、0.65、0.59、0.87、0.78、0.57 和0.43［31］。因此目前测定食品的抗氧化能力不能够只用一种方法，应该选用不同类型的方法。对于近十种方法，而且每种方法都各有利弊，选择的确非常困难。

3.2 抗氧化能力检测的标准化

抗氧化检测方法各有利弊，但许多研究者认为清除自由基的方法(DPPH·、ABTS、ORAC等)生物最相关，因此认为这些方法是测定抗氧化能力的最佳方法。Prior等认为ORAC是其中最好的一种方法［32］。ORAC法采用延长时间30min的反应，抗氧化剂的保护性影响采用荧光衰减的面积表示，避免了选择终点所带来的误差。此法测得的是总的抗氧化活性，而且可自动化，标准化。但该方法需要使用荧光光度计，自动化则需要荧光酶标仪(普通实验室没有)，测定所需时间稍长。也有学者认为使用FRAP方法是评价抗氧化能力的较为适宜的方法，原理明确，操作简便，不需要特殊仪器，易于标准化［33］。鉴于食品抗氧化成分复杂，我国现行的国家标准中尚没有出台测定食品抗氧化能力的标准方法。简便、快速、准确的分析方法是历来分析工作者所致力追求的目标。如何建立食品抗氧化能力检测标准方法，将是我们所面临的巨大挑战。

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Advances in detection methods of food antioxidant activity

ZOU Lei1，ZHEN Shao－bo2，SONG Yang1
(1.Environment Management College of China，Qinhuangdao 066004，China;2.China Institute of Industrial Relations，Beijing 100037，China)

In vitro and in vivo detection methods of food antioxidant activity were summarized.The mechanism and application of detection methods such as DPPH·，ABTS，TBARS，FRAP and ORAC were introduced.The correlations and standardization of detection methods were discussed.This research would provide a reference of choosing antioxidant activities detection method.

antioxidant activity;detection methods;ORAC

TS201.1

A

1002－0306(2011)06－0463－04

2010－05－19

邹磊(1983－)，男，讲师，研究方向:现代食品加工技术。