抗生素在植物保护中的应用及分离纯化研究进展

王苗苗,刘 峥,袁 帅,郝再彬

(1.桂林理工大学化学与生物工程学院,广西 桂林 541004；2.中国农业科学院 植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193)

抗生素指生物在其生命活动过程中所产生的或/并用化学、生物或生化方法所衍生的，能在低微浓度下选择性地抑制或杀灭其它微生物或肿瘤细胞的有机物质。作为生物的次级代谢产物，除从微生物培养液中提取外，有些抗生素已能人工合成或半合成。

随着医用抗生素的发展，用于植物保护方面的抗生素也不断发展起来，至今已有四十多年的历史。抗生素较化学农药[1]具有活性高、选择性强、高效、低毒、环境相容性好等特点，以抗生素代替化学农药来防治植物病虫草害，是现代绿色农业发展的必然趋势。作者在此对抗生素在植物保护[2，3]中的应用及其分离纯化方法的研究进展进行了归纳。

1 抗生素的种类及在植物保护中的作用

抗生素种类繁多，根据化学结构的不同可分为β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、多烯大环类和线性氨基多元醇类等。

1.1 β-内酰胺类抗生素

β-内酰胺类抗生素包括青霉素族和头孢菌素族。20世纪90年代以前，头孢菌素族已由第一代发展到第三代，抗菌谱陆续扩展，对β-内酰胺酶的稳定性明显增强，各国使用的主要产品已有四十余种。进入20世纪90年代以后，发现了第四代头孢菌素，其发展趋势日渐平稳。

β-内酰胺类抗生素呈酸性(pKa=2.5～2.8)，其碱金属盐易溶于水，而有机碱盐难溶于水、易溶于有机溶剂；青霉素族[4]和头孢菌素族分子中含有手性碳原子和共轭系统，均具有旋光性和紫外吸收；青霉素的水溶液在pH值6.0～6.8时较稳定，在酸碱、青霉素酶、羟胺及某些金属离子或氧化剂作用下均可导致β-内酰胺环的破坏而失去抗菌活性。

β-内酰胺类抗生素具有对细菌的选择性杀灭作用，对宿主毒性小。其作用机制是抑制胞壁粘肽合成酶，即青霉素结合蛋白(PBPs)，从而阻碍细胞壁粘肽合成，使细菌胞壁缺损、菌体膨胀裂解。除此之外，其对细菌的致死效应还包括触发细菌的自溶酶活性。因而无细胞壁的或缺乏自溶酶的突变株表现出耐药性，不受β-内酰胺类药物的影响。氨苄青霉素钠、氨苄西林钠和多种头孢类钠盐的多晶型已相继被研发出来，在临床已得到应用，且效果明显。如果能将β-内酰胺类抗生素的多晶型等优点应用于植物保护方面，相信效果也会很可观。

1.2 氨基糖苷类抗生素

氨基糖苷类抗生素是分子中含有氨基糖苷结构的一大类抗生素。1944年，Waksman发现了第一个氨基糖苷类抗生素链霉素。此后，又陆续发现了新霉素、卡那霉素、庆大霉素、西索米星等。据不完全统计，迄今为止发现的天然的氨基糖苷类抗生素超过百种，如果包括半合成的和微生物转化的新型抗生素及其衍生物，累计不下数千种。其中最典型的是链霉素和庆大霉素。

链霉素[5]和庆大霉素均为碱性化合物，其硫酸盐易溶于水，不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂；分子中含有多个手性碳原子，均具有旋光性；链霉素的硫酸盐水溶液在pH值5.0～7.5时最稳定，过酸过碱条件下易水解失效；链霉素在230 nm处有紫外吸收，庆大霉素在紫外区无吸收。

氨基糖苷类抗生素对各种需氧的G-杆菌具有强大的抗菌活性，对金黄色葡萄球菌(MRSA)和表皮葡萄球菌(MRSE)也有较好的抗菌活性，链霉素、卡那霉素还对结核杆菌有效，但对G-球菌作用较差。氨基糖苷类抗生素的作用机制是抑制细菌蛋白质合成，以及破坏细菌胞浆膜的完整性。氨基糖苷类抗生素的临床应用较为广泛，医用的链霉素和土霉素曾用于防治某些果蔬的病害，取得了一定效果，引起了广泛的关注，但由于像临床一样产生抗药性[6]，其在植物保护方面的应用还是受到了限制。

1.3 四环素类抗生素

四环素类抗生素是四并苯或萘并萘的衍生物，在基本结构中改变取代基就构成了不同的抗生素，常用的四环素类抗生素有四环素[7，8]、金霉素、土霉素和多西环素等。20世纪40～50年代，金霉素、土霉素、四环素、去甲环素相继从链霉菌发酵液中分离得到，它们有着相似的、广泛的抗菌谱以及极为相似的化学结构，被认为是一类新的抗生素。

四环素类抗生素具有酸碱两性，遇酸或碱均能生成相应的盐；其结构中含有不对称的碳原子，具有旋光性，能进行定量和定性的分析；同时又含有共轭双键系统，在紫外光区有吸收，在紫外光的照射下，其降解产物能产生荧光。

四环素类抗生素是由链霉菌产生的使用最广泛、用量最大的抗生素种类之一，一般通过与核蛋白体的30S亚单位结合，阻止氨酰基tRNA与核蛋白体结合产生药理作用，起到抑菌杀菌的作用。目前，四环素类抗生素在环境中的大量残留带来了潜在的环境风险，其原因在于此类抗生素的溶解度较小，不能被土壤或植物充分吸收，从而对植物的保护作用不明显。Miyazaki等用红外光谱仪、X-射线衍射仪、热分析法等手段研究发现四环素有两种不同的晶型Ⅰ、Ⅱ，在同种溶剂中，晶型Ⅱ的溶解度明显高于晶型Ⅰ[9]，这是此类抗生素产生生物有效度差异的原因，为植物保护工作者提供了一个重要的依据。

1.4 大环内酯类抗生素

大环内酯类抗生素含有一个大的内酯环，其结构相似，均由两部分组成：一部分为非糖部分，另一部分为糖基部分。1952年，从红色链霉菌培养液中分离出来一种碱性抗生素红霉素，是发现最早的此类抗生素，其抗菌能力强，研究和应用较广泛，为各国药典所记载。后来陆续发现的罗红霉素、阿维菌素、阿奇霉素和克拉霉素均被《中国药典》所记载[10]。

大环内酯类抗生素为无色碱性化合物，易溶于有机溶剂，与酸生成易溶于水的盐；在酸性溶液中苷键易水解，在碱性溶液中内酯环易被破坏；红霉素在干燥状态下很稳定，结晶在室温下可保存一年，在水溶液中稳定，在 pH值6.0以下易被破坏；含手性碳，其比旋光度为-71°～-78°(20 mg·mL-1无水乙醇)，不受温度和浓度的影响。

Avermectins是一族结构相似的大环内酯类抗生素，具有高效广谱的杀虫活性，且在光照和植物的作用下可完全分解，其作用机理是通过干扰害虫神经生理活性，刺激虫体产生γ-氨基丁酸，从而阻断运动神经信息的传递活动。Avermectins可以同时驱杀几乎所有的线虫类、昆虫类和螨虫类寄生虫，每次的驱净率达80%～100%，效果显著。Avermectins的结晶含有8种成分，田益民等对其结晶工艺进行改进，改进后得到的Avermectins结晶成品为代表性的生物农药，因其高效、低毒、高选择性以及环境相容性好等特点，受到农药界的高度重视，是未来农药的发展方向[11]。

1.5 多烯大环类抗生素

多烯大环类抗生素又名多烯抗生素，是抗生素中一个化学类群，分子中包含由25～37个碳原子组成的大内酯环，环的一部分有共轭烯烃结构，对应部位有羟基，并由苷键连接一个或多个氨基糖，由共轭双键数目不同分为三、四……七烯。多烯大环类抗生素对真菌具有很好的抑制作用[12]，其抗真菌谱广，主要包括两性霉素B、那他霉素[13]、制霉菌素、曲古霉素等。

多烯大环类抗生素难溶于水，具有特异紫外吸收峰值，易被光、热、氧等破坏。

应用最多的多烯大环类抗生素为那他霉素和两性霉素B。那他霉素是由纳塔尔链霉菌发酵产生的抑菌物质，作用于真菌细胞质膜，与质膜中含有的麦角甾醇作用，损伤细胞质膜，造成细胞内物质的泄漏，从而起到杀菌的作用(对无麦角甾醇的质膜无影响)，两性霉素B作用机制亦如此。多烯大环类抗生素多应用于食品防腐和抗真菌疾病，对于在植物保护中是否有应用前景尚未见文献报道，由于植物中感染真菌的部位存在于植物的根、叶、茎、果实、种子等具有细胞结构的部位，若能将多烯大环类抗生素作用于这些部位，可能会有明显的抗真菌效果。

1.6 线性氨基多元醇类抗生素

1994年，Siol-Suh等首次在UW85发酵液中分离出活性代谢产物Zwittermicin A，同年Manker报道了该物质的结构式。Zwittermicin A是已知的唯一的氨基多元醇类抗生素，其纯品呈无色粉末状，能通过0.2 μm滤膜。

Zwittermicin A溶于水，微溶于甲醇、吡啶，不溶于丙酮、乙腈、己烷。Zwittermicin A在纯水中于210 nm处有特征吸收峰，在pH值为7.0时呈离子状态，比旋光度[α]D=+8.9。可与茚三酮缩合成蓝紫色缩合物，与硝酸银成正反应[14]。对酸性磷酸酶、DNase、RNase和蛋白酶都不敏感。在酸性条件下能稳定存在，在碱性条件下易水解。

Zwittermicin A是由苏云金芽孢杆菌(Bt)产生的一种新型广谱抗生素，可抑制多种真核微生物和原核微生物，其中包括多种植物病原真菌和卵菌，并且与Bt毒素共同使用时能显著提高苏云金芽孢杆菌的杀虫活性，可作为增效因子来提高苏云金芽孢杆菌的防效，从而减少Bt毒素的用量、延缓抗性的产生、拓宽杀虫谱，使苏云金芽孢杆菌这一著名的生防菌在可持续农业中发挥更大的作用[15～17]。国外对Zwittermicin A的研究已有十几年的历史，而国内对其研究较少，特别是对其晶型的研究还未见文献报道。

1.7 其它

氯霉素是早在1947年就由委内瑞拉链霉菌[18]的发酵液提取到的一种具有旋光性质的抗生素，易溶于低级醇和丙酮，微溶于水，不溶于苯和乙醚。对热稳定，在弱酸或中性溶液中稳定，在碱性溶液中失效。20世纪60～70年代氯霉素曾作为防治水稻白叶病的主要药剂之一，后因其它药剂的开发及本身某些不足而逐渐减少应用。20世纪90年代，氯霉素与其它药剂混用在水稻白叶枯病的防治中取得很好的效果。2006年，Gamberini等[19]运用FTIR和DSC等分析技术，发现了氯霉素棕榈酸酯的三种晶型A、B、C，并阐明了不同晶型对其化学稳定性、药品剂型、溶解特性即对其生物利用度的影响，为氯霉素用于植物病菌防治提供了重要依据。

林可霉素又名洁霉素，是由林可链霉菌林可变种产生的一种林可胺类碱性窄谱抗生素。能溶于甲醇、低级醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿等，微溶于水，以盐的形式存在更稳定。在作物改良方面，通过原生质体融合并选择胞质链霉素抗性以转移烟草的雄性不育性状，或通过原生质体融合转移胞质的抗林可霉素因子都取得了成功。杨梁等[20]制备并分析了盐酸林可霉素的单晶Ⅰ、Ⅱ，发现晶型Ⅰ的溶出度快于晶型Ⅱ，为制定其在作物改良上的质量标准提供了科学依据。

2 抗生素的分离纯化方法

2.1 抗生素分离纯化的意义

抗生素是微生物的次级代谢产物，一般在微生物的发酵过程中产生。微生物在发酵时需要一定的营养物质，在发酵完成时会形成复杂的多相体系，因此发酵液中含有残留的菌丝体、微生物细胞代谢产物、残余的培养基等，杂质含量很高，而目标抗生素含量很低，甚至是微量的。由于某些抗生素的化学结构及理化性能非常相似，某些抗生素含有生理活性物质，极不稳定，遇热或遇酸碱等某些化学试剂易失活分解等原因，与一般的化学合成药物相比，抗生素的分离纯化工艺复杂、技术不成熟、生产成本高。因此，抗生素的分离纯化工艺已成为抗生素产品能否符合质量标准并且产业化的关键。

2.2 抗生素的分离纯化方法

常用的抗生素分离纯化方法有溶剂萃取法、沉淀法、结晶法、吸附法、离子交换法、色谱法、膜分离法、电泳分离法等。在分离纯化抗生素时，可根据杂质含量的多少和分离的难易程度，单独或同时选用上述方法，以达到更好的效果。

2.2.1 溶剂萃取法

溶剂萃取法是利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同，使溶质选择性地从一种溶剂转移到另一种溶剂中而得到分离纯化或浓缩的方法，是生物工业中一种重要的传统分离提取方法，广泛应用于抗生素工业中。王印[21]将螺旋霉素的发酵液除去蛋白质，过滤，滤液于醋酸丁酯-水相中萃取，除去水相，醋酸丁酯提取液经40 ℃、50%的无盐水洗涤，静置分层，放水至乳化层为白色为止，再经水提2次，合并水提液并通过真空泵缓缓输入托丁酯罐，过滤，结晶，真空干燥后得到螺旋霉素纯品。

近年来溶剂萃取法的萃取机制和方法不断完善，相继出现了许多新的萃取技术。其中超临界CO2萃取技术在天然产物分离方面的应用已经在许多领域实现了工业化，双水相萃取法和离子液体萃取法已在抗生素分离提纯中得到了应用。张咏梅等[22]用14%PEG4000-20%Na2HPO4对泰乐菌素的发酵液进行萃取，收率达到52.4%，省去了过滤的操作，减少了泰乐菌素的失活，纯度明显提高。茹静[23]研究了疏水性离子液体[Bmim]PF6、[Omim]BF4作为萃取剂萃取红霉素，提高了选择性，使痕量的红霉素得到了分离和富集。

2.2.2 沉淀法

沉淀法是指在抗生素试液中加入适宜的沉淀剂(如高浓度的盐、有机溶剂、聚电解质)，使被测组分沉淀，或将共存组分沉淀，过滤后再改变条件使沉淀物重新溶解，从而达到分离纯化的目的。酸性抗生素可以和有机碱反应形成盐而沉淀；碱性和两性抗生素可以以不同种类的酸作为沉淀剂而沉淀；多肽类抗生素可用盐析法使溶解度降低而沉淀。沉淀后的抗生素用水或稀酸溶液溶解，再用有机溶剂提取，最后经过浓缩即可得所需抗生素。

沉淀法用于抗生素的提纯主要起浓缩的作用，纯化效果较差，通常用于抗生素的初步提纯，结合吸附法、色谱法等效果更佳。王国联等[24]采用反应沉淀法制备阿奇霉素药物超微粉体，其方法是准确称取阿奇霉素的原料药溶于稀盐酸中，用0.45 μm的滤膜过滤，在20 ℃、磁力搅拌条件下快速加入盛有0.08 mol·L-1NaOH溶液的烧杯中，反应沉淀2 min，过滤，在60 ℃烘箱中干燥即得到阿奇霉素的超微粉体，纯化效果较好。

2.2.3 结晶法

结晶法是先形成过饱和溶液(结晶的动力)，然后加入晶种或搅拌使形成晶核，晶体生长后完成结晶，这些过程在时间上的顺序可能不同，可以连续或兼顾进行。根据形成过饱和溶液的方式的不同，工业提纯分离抗生素常用的结晶方法有蒸发结晶、化学反应结晶、过饱和冷却结晶和盐(溶)析结晶等。

蒸发结晶是使溶液在加压、常压或减压条件下加热蒸发除去一部分溶剂，从而形成过饱和溶液，以达到或维持溶液过饱和度，使晶核形成，晶体长大。此法适用于溶解度随温度变化不显著的抗生素的结晶。化学反应结晶法是通过调节溶液pH值或加入反应剂使其发生化学反应产生新的物质，其浓度超过溶解度而结晶。过饱和冷却结晶法是使溶液冷却降温以维持一定的过饱和度，无需除去溶剂。此法适用于溶解度随温度降低而显著减小的抗生素的分离纯化。盐(溶)析结晶法是通过向某物质的饱和或不饱和体系中加入其它物质，使溶质的溶解度降低形成过饱和溶液而结晶。Gamberini等[19]以氯仿作溶剂，蒸发结晶得氯霉素棕榈酸酯晶型A；以乙醇和甲醇作溶剂，冷却结晶得氯霉素棕榈酸酯晶型B和C。

2.2.4 吸附法

吸附法是利用吸附剂与抗生素之间的分子力作用而将抗生素吸附在吸附剂上，达到分离除杂的目的。常用的吸附剂有活性炭、硅胶、大孔吸附树脂等比表面积较大的物质。与经典的活性炭等吸附剂相比，大孔吸附树脂具有选择性好、机械强度大、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、可反复使用等优点，近年来在微生物天然产物的分离提纯中得到了普遍的应用。

大孔吸附树脂适合于吸附水溶性或脂溶性的各种抗生素，其分离、提取、浓缩、纯化等应用基本涵盖了抗生素的所有类型。王海燕等[25]用大孔树脂HZ816分离纯化那他霉素，调节那他霉素浸提液的pH值为7.0，采用中速1.5～2.5 BV·h-1(树脂床体积)作为吸附的流速，然后用120 mL水、40%乙醇净化后，用pH值为11的氢氧化钠和80%乙醇的混合溶液进行洗脱(流速0.5 BV·h-1)，再用1 mol·L-1HCl溶液调节pH值至5.0～6.5，使那他霉素沉淀析出，冷却静置12 h，离心分离，用去离子水洗至中性，干燥，得那他霉素白色粉末，HPLC测得其含量为98.3%。

2.2.5 离子交换法

离子交换法[26]是利用离子交换剂与溶液中的离子之间发生交换反应，选择性地将目的物质吸附上去，再用适当的洗脱剂洗脱下来，使杂质与目的物质分离的方法。某些天然物质如泡沸石和煤经过硫化制得的硫化煤可作为离子交换剂，目前应用最多的是有机离子交换剂，即离子交换树脂，是一类立体结构的多孔高分子聚合物。

抗生素含有多种化学基团，在强酸强碱条件下易失活，因此分离纯化抗生素所用的离子交换树脂主要为弱酸性阳离子交换树脂和弱碱性阴离子交换树脂。大孔离子交换树脂以苯乙烯和丙烯酸为单体，加入二乙烯苯交联剂，相互之间交联聚合形成多孔骨架结构，在骨架上导入不同的化学活性基团而制成[27]，是吸附性和筛选性相结合的分离材料。其本身的吸附特性和离子交换同时作用，再根据分子量的大小和离子的性质选择一定的溶剂洗脱，从而达到分离、纯化、浓缩抗生素的目的。

2.2.6 色谱法

色谱法是基于被分离物质分子在两相(固定相和流动相)之间分配系数的微小差别所产生的不均匀分配进行分离的方法，是一种多级分离技术。当两相进行相对移动时，被测物质各个单一组分对两相不同的亲和力和两相不均匀扩散的可能性导致其在固定相和移动相之间的不均匀分配，使原来微小的分配差异进一步扩大，各组分得到分离。常用于抗生素分离的色谱法有薄层色谱法、硅胶吸附柱色谱法和高效液相色谱法等。姚圆等[28]利用固相萃取-高效液相色谱-荧光检测法分析了蔬菜中四环素类抗生素的含量，先对蔬菜样品进行溶液超声提取，再用高效液相色谱法对其进行了富集。

2.2.7 膜分离法

膜分离法是依据物质分子尺度的大小，利用天然或人工合成的具有选择透过性的薄膜，在外界能量或化学位差的推动作用下，对双组分或多组分体系进行分离、分级、提纯或富集，从而达到分离、提纯和浓缩的目的。依据膜孔径的不同，膜分离技术分为微滤、超滤[29]、纳滤、反渗透和液膜等。

不同膜分离技术具有不同的分离机理，在抗生素分离纯化中体现出独特的优势。如超滤法可在不使用破乳剂的情况下有效除去抗生素发酵液中起乳化作用的蛋白质及其它大分子物质，消除乳化现象；反渗透法在室温下就能分离、浓缩热敏性的抗生素。与传统工艺相比，膜分离法具有操作简单、高效节能、可持续生产、无二次污染、常温常压下可操作等优点。

近年来液膜分离抗生素[30，31]的报道很多，膜分离技术作为新型的分离方法，在抗生素的分离纯化中得到了广泛的研究和应用。Sahoo等[31]采用液膜技术从发酵液中分离头孢菌素C,建立了两相的界面处和膜相中的数学模型，并对其反应时间、搅拌速度、载体浓度进行研究，实际测得的数据与数学模型一致。

2.2.8 电泳分离法

电泳分离法是利用物质在电场的作用下，以不同的速度向电荷相反的方向移动的这一电化学差异分离纯化抗生素的方法。带电粒子的迁移率影响着电泳分离的效果，迁移率与物质的电荷成正比，与质量成反比，电荷越大，质量越小，迁移率越大，正负离子的迁移方向相反最容易分离；由于电泳是在一定的电解质溶液中进行的，所以电解质的组成、溶液的粘度也会影响带电粒子的迁移率。依据电泳分离的原理及其影响因素，通过改变电解质的组成，可让带电粒子形成配合物或不带电荷，便于分离。

毛细管电泳法是近年来发展迅速的精制分离技术。毛细管电泳法以高压电场为驱动力、以毛细管为分离通道，依据各组分间淌度和分配行为的差异而实现液相分离，具有简单、高效、快速、环境污染少和易于自动化等显著优点[32]，可用于分离纯化微量物质并一机多用，已成为与高效液相色谱法相媲美的分析科学的前沿技术。李志伟等[33]利用高效毛细管电泳方法测定头孢地尼原料药的含量，采用的分离电压为20 kV、检测波长为254 nm。

3 结语

植物用抗生素是微生物代谢的产物，毒性明显低于化学农药，在植物体内的半衰期短、效果好，对环境的污染小。我国植物用抗生素的研究始于20世纪50年代初期，近几年来，这个领域的研究显现出了诱人的前景，目前世界各国都已将植物用抗生素研究列入了国家重点规划。但抗生素在植物保护中的研究与应用要注意以下问题:

(1)抗生素多晶现象的研究还处于初级阶段，抗生素晶型对其在植物中的稳定性、毒性和生物利用度的影响有必要深入研究。

(2)在生产或贮存过程中，甚至因使用不当，抗生素可产生内源性的杂质而对植物产生药害。

(3)在医用方面广泛应用的链霉素、氯霉素和土霉素等，曾被应用于农业上防治相关的作物病害，但直接使用会对作物产生病害，并存在稳定性及抗药性等问题，在植物保护中的研究越来越少。此外，某些抗生素对作物有药害且使用量较大，已很少被研究使用。未来的研究需致力于找寻活性更高、毒性更低、对环境污染更小的新型植物用抗生素。

(4)通常抗生素在极高的稀释度下仍能选择性地抑制或杀死微生物，因此，在寻找新的植物用抗生素的同时，必须合理适度地使用抗生素，避免滥用。

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