白血病干细胞研究现状

吕俊廷 (综述), 杨志刚(审校)

(广东医学院附属医院血液内科,广东医学院检验学院, 广东 湛江 524001)

自从 1994年 Lapidot等[1]首次报道了具有 CD34+/CD38-表型的人急性髓性白血病干细胞(leukem ia stem cells,LSC)以来,人们对 LSC的研究不断深入。LSC是指白血病细胞中存在的一种类似正常造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)的但数量较少且具有自我更新能力,分化潜能的细胞。是白血病的发生发展、耐药、复发及预后的影响因素之一。本文将其研究现状作一综述。

1 LSC的来源

对于 LSC的来源,尚没有明确的结论。目前存在四种观点：①来源于 HSC;②来源于部分分化的造血祖细胞;③来源于血液血管干细胞和 GMP(granulocyte macrophage precursors)细胞;④来源于相对成熟的白血病细胞。

第一种观点是在比较 LSC与 HSC的生物学特点提出来的。LSC与 HSC都具有自我更新和分裂增殖能力;具有多种相同的细胞表面标志性分子和多条相同的自我更新调节通路。另外,在细胞端粒酶的活跃表达、抗凋亡调控通路的活化、膜转运体活性的升高,以及迁徙与转移的能力上,两者都有着明显的相似性。有实验证实,干细胞与肿廇干细胞在一定的条件下还可以相互转化,如胚胎植入体内可以诱导成畸胎瘤,而畸胎瘤细胞注入鼠囊胚内细胞团可以形成正常胚胎[2]。

第二种观点的依据主要来自对白血病不同发展阶段细胞特征的研究。这些研究表明,早期突变可能发生在造血干细胞上,最终的转化事件改变了造血干细胞或下游祖细胞表型[3]。这里有两种可能,一是定向祖细胞通过累积额外突变获得干细胞样的自我更新能力,二是正常造血干细胞通过累积基因组和(或)基因的表观遗传变化,例如丢失了凋亡能力,最终导致其分化到定向细胞阶段又获得自我更新能力。Levis等[4]研究表明,由 t(15;17)平衡易位导致的 M3的致病融合基因 PML-RARα(维 A酸受体 a),仅出现在 CD34-/CD38+的细胞中,不出现在 CD34+/CD38-的干细胞中,说明白血病的转化事件发生在干细胞的以后阶段 -祖细胞,甚至是成熟细胞。另外,已经有研究认为急性白血病来源于粒巨祖细胞(granulocyte-macrophage progenitors),其和造血干细胞一样的自我更新能力是获得性的[5]。Cozzio等[6]用逆转录病毒转导纯化HSC、CMP(commonmyeloid progenitors)和 GMP(granulocytemacrophage progenitors),使它们带有白血病融合基因 MLL-ENL,3种细胞均在小鼠体内诱导出急性髓系白血病(acutemyeloid leukemia,AML)模型,第 1次用实验直接证明了LSC可来自于分化了的祖细胞。

第三种观点来自于对慢性粒细胞白血病(CML)的研究。BCR-ABL融合基因为 CML的细胞遗传学标志。Gunsilius等[7]在 CML患者内皮细胞中发现有BCR-ABL融合基因存在,CML干细胞源于 CML患者骨髓中的血液血管干细胞群体,表达 BCR-ABL融合基因。在单细胞水平上证实该细胞群体有成血管内皮细胞和造血的潜能,且可在健康小鼠体内复制出CML。CML干细胞群体的分离确认证实 CML的基因转化发生在较 HSC更为原始的血液血管干细胞水平上。Jamie-son等[8]发现多数慢粒病人在加速期时体内 GMP(granulocytemacrophage precursors)细胞内 βcatenin的核定位增加,在急变期更是显著,而 β-catenin与自我更新能力相关,这意味着慢粒急变的本质是在 GMP细胞水平获得自我更新能力转化成了 LSC。

第四种观点认为相对成熟的白血病细胞可以通过逆向分化重新获得 LSC的性质。Tsuji-Takayama等[9]用 5-氮杂胞嘧啶核苷(5-azacytidine,5-AzaC)使小鼠胚胎细胞已分化细胞逆分化成具有细胞 -细胞间界限不太明显的干细胞样形态结构的细胞,而且这些逆转细胞获得部分干细胞标志物阳性表型。von Melchner等[10]用在全反式维甲酸存在的人胎盘条件培养基(半固体培养基)上连续传代,使人前髓细胞性白血病细胞(HL-60)逆转为重新获得增殖潜能而末端分化(HL-60原来可还原四唑硝基蓝 NBT的活性)特征消失的细胞,这些实验都证明了肿瘤细胞在一定条件下可逆转为肿瘤干细胞或肿廇干细胞样细胞。

2 LSC免疫表型

免疫表型是细胞功能和身份的标志。LSC具有干细胞的特性,也具有与 HSC相似的免疫表型。目前的研究热点是寻找 LSC的特殊表型,从而将其同 HSC区别开来,进行针对于 LSC的特异性治疗。1994年,Lapidot等[1]报道了具有 CD34+/CD38-表型的人急性髓性白血病干细胞,这是人类恶性肿瘤干细胞的道次报道。1997年、2000年 Blair等[11,12]报道了具有CD34+/Thy-1(CD90)-和CD34+/c-kit(CD117)-的人急性髓性白血病干细胞,2002年 Peled等[13]报道了具有 Ph+/CD34+/CXCR4+表型的慢性髓细胞白血病干细胞,2005年 Feller等[14]报道了 CD133 and/or CD34的人急性髓性白血病干细胞。2006年Deshpande等[15]通过融合基因 CALM-AF10衍生的AML小鼠模型发现了 LSC和 HSC的差异,在这个模型中,LSC并不表达髓系抗原而表达淋巴系的特殊标记 -B220。而且在 CALM-AF10衍生的人 AML中也发现了 B220+群体。2007年 Hosen等[16]研究发现,CD96可能是急性髓性白血病干细胞的一个独特的表型标志。Jordan等[17]报告了 AML患者 LSC表达CD123,而正常 HSC不表达,van Rhenen等[18]发现CLL-1在 CD34+CD38-的 LSC上有较高表达,在正常 CD34+CD38-的 HSC上却没有表达。对 CD34+的 AML患者,CLL-1是恶性 CD34+CD38-干细胞的一个标记,其表达水平在初诊和复发时无显著差异。Cox等[19]用原代培养的人类急性淋巴细胞白血病细胞进行研究发现,只有具有 CD34+/CD19-或 CD34+/CD20-细胞表面标志的亚群细胞在移植入 NOD/SCID小鼠后才能引发人类急性淋巴细胞白血病,即在人类急性淋巴细胞白血病中存在有少量以 CD34+/CD19-或 CD34+/CD20-为特异细胞表面标志的肿瘤干细胞。Jin等[20]用活化的抗 CD44的单克隆抗体Mab(H90)在对正常的组织没有影响的情况下,可以消除 NOD/SCID小鼠体内 AML LSC。CD44+可否作为 LSC的一个表面标记,还有待于进一步研究。

目前较公认的急性髓系白血病(M3除外)干细胞的免疫标志为 CD34+CD38-CD71-HLA-DRCD90-CD117-CD123+。至于其它类型的白血病干细胞表面标志,还需更多实验来支持,但 CD34+/CD38-是 LSC表面标志的金标准。

3 LSC的调控机制

目前有关 LSC的分子调控机制报告较多,归纳起来主要包括磷酸肌酸激酶 3(PI3K)、细胞膜酪氨酸激酶 -3(FLT3)、Bm i-1基因、MLL基因 、Notch家族基因 、HOX家族基因 、p53 、GATA-1、STAT-5等,对这些调控分子的研究有助于我们更深刻了解 LSC的特性,有助于发现白血病新的治疗措施。

4 LSC的耐药机制

LSC的耐药机制止前还没完全阐明,但可能与LSC的几个固有特征有关：①LSC通常处于相对静止或休眠状态,而当前的抗肿瘤药主要是靶向迅速增生的分裂期细胞,因此 LSC不受影响。Guzman等[21]的研究表明,平均高达 96%的 LSC处于 G0期。处于这一时期的细胞对常用的化疗药物不敏感,这也使得LSC能够避开传统的细胞周期性化疗药物的攻击,AML患者经化疗缓解后,未被清除的 LSC还能继续维持疾病,最终造成绝大多数患者仍会复发。②LSC表面表达多种膜转运蛋白,能够将 Hoechst 33342等荧光染料以及多种化疗药物排出细胞外,其中 ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)膜转运蛋白发挥了重要的药物外排作用。以往的研究发现,肿瘤细胞上的ABC(ATP结合盒)转运器可以在癌细胞中过度表达,并将已经进入细胞内的多种抗癌药物又“泵”出癌细胞,从而诱发癌细胞的多药耐药性,降低抗癌化疗药物的临床疗效。对此,临床上常利用耐药逆转剂来应对,但最近 Raaijmakers等[22]的研究发现,常用的耐药逆转剂维拉帕米和环孢菌素 D衍生物PSC833,只能优先阻止抗癌药物米托蒽醌从正常 HSC中泵出,却无法有效抑制米托蒽醌从 LSC中排出,这也对白血病的治疗方法提出了一个新的问题。③高效的 DNA修复机制和凋亡信号的抵制等。

本组筛查对象中发现实性结节的处理采用Fleischner学会处理指南[4]，初始发现结节直径在6mm以上的，需要把结节的大小、形态、密度及所处肺叶的位置在记录表上详细填写，而对于初始发现结节在6mm以下的，如果结节出现分叶、短毛刺、胸膜凹陷等危险因素的也需要提高警惕，应建议1～3月内再次给予低剂量CT扫描复查，观察结节的形态、大小及密度情况，如果此类结节同时存在分叶、短毛刺及胸膜凹陷等多种危险因素的[5]，应建议活检或直接手术切除。

5 LSC理论的临床价值

目前 LSC理论认为,化疗可以杀死白血病肿廇细胞,但杀灭不了白血病干细胞,肿瘤干细胞的存在是白血病容易复发及耐药的原因之一,白血病干细胞的多少也是影响白血病患者预后因素之一。白血病肿廇细胞在特定条件下可逆转为白血病干细胞,逃避化疗药物的伤害,这是白血病复发、耐药及预后不良的原因之一。因此,对 LSC的深入研究,将为白血病的早期诊断及治疗提供新的思路和策略。

5.1 LSC在白血病的早期诊断：目前临床明确诊断AML的条件是要求形态异常的 AML细胞达到 30%以上,这从病程上讲已经不是早期诊断,如果能利用抗体选择方法识别出更特异的 AML LSC表面抗原,则能在AML形态学特点尚未出现之前,即发病初期的分子水平上明确 LSC的分子遗传学标记,实现 AML更早期的诊断。

5.2 LSC在白血病的预后判断：LSC存在是白血病复发的因素之一,在白血病治疗过程中追踪检查 LSC的变化,联合微小残留病(MRD)的检测技术,可以更好地判断白血病患者的预后。

5.3 LSC在白血病治疗上的研究：导致白血病复发与耐药的根源是 LSC的存在,只有选择性地彻底杀死LSC才有望彻底治愈白血病,就目前研究所知,可以有以下几种思路和策略。

5.3.1 根据 LSC表面特异性分子标记的不同,或其表达的蛋白质差异,对其实施靶向杀灭。对于白血病而言,靶向抗原可选择 CD123(IL-3R)分子,其表达于 LSC而非正常 HSC的特性很适合作为靶向治疗的目标。大多数 AML母细胞表面表达 IL-3R。Feuring-Buske等[23]分别用体外培养和移植至 NOD/SCID小鼠体内形式证明了白喉毒素 -IL-3融合蛋白(DT388IL3)对白血病母细胞和 LSC群有毒性作用,而对正常前体细胞无毒性。在化疗前或化疗中同时应用ABCG2抑制剂或抗 ABCG2抗体,可增加 LSC对化疗药物的敏感性,能有效帮助清除 LSC。现已应用于临床的吉姆单抗(gemtuzumab)/奥佐米星(ozogamicin)是人源化的抗 CD33单抗和细胞毒抗肿瘤抗生素刺孢霉素(calicheamicin)的偶联物,用于治疗复发的 AML,并取得了显著疗效。最近的发现抗 CD44的单抗可以消除 AML干细胞[20]。

5.3.2 干扰白血病微环境：LSC需要与其微环境相互作用才可支持其干细胞特征,如果 LSC细胞不能够到达微环境便不能继续繁殖。最近研究发现黏附分子CD44可以介导 LSC在骨髓和脾中归巢,利用一个可以直接黏附在 CD44上的单克隆抗体 H90,可显著减少人类 AML细胞移植到 SCID小鼠身上的能力。

5.3.3 诱导 LSC的特异免疫：异基因供体细胞介导的继发移植物抗白血病效应,在有些患者可能以 LSC为靶向。Bonnet等[24]报道了用细胞毒性 T淋巴细胞(CTL)克隆特异性针对次要组织相容性抗原,抑制人AML细胞在 NOD-SCID小鼠体内的植入,并证实了该抑制作用由 CTL直接针对 LSC介导。该研究表明适当的移植物调控及正确鉴定和选择 T淋巴细胞克隆,能有效引发抗 LSC免疫反应,防治异基因干细胞移植后的白血病再复发。

5.3.4 促进分化：通过诱导 LSC分化为成熟细胞,从而失去自我更新能力。目前肿瘤分化诱导治疗在维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病中取得显著疗效。临床上诊断为急性早幼粒细胞白血病的病人,使用全反式维甲酸诱导 LSC分化,同时结合化疗药治疗后,约有90%的病人获得完全缓解,70%的病人治愈。

5.3.5 诱导凋亡：针对肿瘤特异的癌蛋白进行靶向治疗可以诱导肿瘤细胞分化成熟,然后象正常细胞一样凋亡。全反式维甲酸(RA)治疗 AML和伊马替尼(Imatinib)治疗费城染色体(Bcr-Abl)阳性的慢性骨髓性白血病(CML)是诱导分化治疗肿瘤中两个成功的例子。Fujisaki等[25]发现 bestain,一种氨基肽酶抑制剂,能选择性杀伤 ph+的 CML干细胞并且能刺激正常造血。可能的机制是 CML的 CD34+细胞上 fas受体表达增加,抗 fas受体的 IgM能诱导其凋亡,而bestain就是协同抗 fas受体的 IgM、TNFα、IFNγ等物质诱导慢粒干细胞凋亡的。

5.3.6 针对 LSC的特殊分子调控机制的靶向治疗：FLT3的抑制剂、核因子 NF-κB的蛋白酶抑制剂(MG-132)、PI3K抑制剂等都可以通过其分子调控途径作用于 LSC,而对正常的 HSC影响甚少。

5.3.7 多靶点联合治疗：通过 NF-κB及 PI3K介导的信号传导通路调控 LSC生存,以 p53介导的凋亡信号通路调控 LSC死亡,将阻断生存信号与激活死亡信号联用,能更好的靶向 LSC。

5.3.8 抑制运载体的作用：ABC运载体的高表达使得常规细胞毒药物不能对 LSC发挥应有的作用,从而增加了对 LSC靶向杀伤的难度。通过有效抑制运载体也许可以使药物进入到细胞内对 LSC产生杀伤作用。

5.3.9 削弱增殖能力：Phatak等人使用小分子药物RHPS4选择性抑制白血病干细胞的端粒酶催化亚基(hTERC)的活性,结果造成白血病干细胞增殖能力明显下降。

5.3.10 未明的机制：Guzman等 研究发现,TDZD-8(4-benzyl,2-methyl,1,2,4-thiadiazo-lidine,3,5-dione)可能通过抑制 PKC和 FLT3信号转导途径释放游离的巯基化合物,快速破坏白血病干细胞的完整性,在 2h内杀死白血病干细胞,而正常的干细胞则不受影响。但其靶向杀伤的机制还有待研究。[26]

随着 LSC研究的不断深入,使我们从一个全新的角度认识了白血病的发生发展,为白血病发病的分子机制研究、疾病监控、治疗策略以及预后判断提供理论依据。下一步的研究目标是进一步了解 LSC的特性,尤其是 LSC的起源,寻找 LSC与HSC之间的根本差异性,为特异性地消除 LSC,并最大程度地减少对正常HSC的影响提供理论基础。为彻底治愈白血病找到最有效的途径。

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