微生物维生素E产业化开发进展

张姗姗

(青岛科技大学化工学院，山东青岛 266042)

微生物维生素E产业化开发进展

张姗姗

(青岛科技大学化工学院，山东青岛 266042)

维生素E是一种脂溶性抗氧化剂，仅在光合细菌和高等植物中合成，具有重要的生理学功能。纤细裸藻能有效积聚α－生育酚。本文综述了通过代谢和基因工程、培养系统和反应器等方面的研究来有效生产生育酚的进展情况，旨在促使工业化生产维生素E成为可能。

维生素E;纤细裸藻;培养系统;光生物反应器

Abstract:Vitamin E are fat－ soluble antioxidants that is synthesized by photosynthetic and higher plant，have most significant physiological roles.Euglena gracilis is promising for commercial production of α －tocopherols，this prograph have investigated metabolic and genetic engineering、cultivation systems and photobioreactors for efficient production of tocopherol，make it possible for large － scale commercial production.

Key words:vitamin E;euglena gracilis;cultivation systems;photobioreactors

1 简介

维生素E(VE)是光合作用细胞合成的脂溶性抗氧化剂。维生素E临床上可用于治疗老年性痴呆症、高血压、冠心病、心肌梗塞、动脉硬化、血栓和不孕症等［1］。作为抗氧化剂和自由基捕获剂，维生素E还可以保护类囊体成分免受氧化破坏，在电子转移反应、细胞膜渗透性和流动性方面有重要作用，因此它可以用作膜稳定剂。

VE的生理学活性高，天然VE作为营养补充剂和抗氧化剂广泛应用于医药、保健品、食品、营养品和化妆品中，但价格昂贵主要供人类使用。化学合成的价格低廉，但中间产物对人体健康有潜在威胁，只用于饲料加工。VE是生育酚类化合物的总称。根据类异戊二烯基侧链饱和度的不同分为生育酚和生育三烯酚，根据芳环上甲基位置和数目的不同又各有α、β、δ及γ 4种类型。其中α－生育酚生物学活性最高［2］。所有的同系物存在于植物和光合作用的微生物中，它们的浓度和比例取决于植物种类、组织、微生物和培养条件。由于α－生育酚是最有效的亚型，因此选择有利于它合成的菌株和培养条件来发酵生产。

2 天然生育酚的来源

2.1 高等植物作为生育酚的来源

生育酚普遍存在于植物组织，尤其是双子叶植物的叶和种子、豆油、麦麸和小麦胚芽中。传统上，用有机溶剂如己烷来提取植物组织中的生育酚;现在考虑使用超临界流体如超临界CO2来提取［3］。植物油富含生育酚，但是高等植物作为其来源存在一个问题，就是生育酚含量很低。

2.2 微生物作为生育酚的来源

微生物希望有高生育酚浓度、高比例α－生育酚、高细胞生长率、高细胞浓度、简单的培养条件、便宜的培养媒介、低污染敏感性等特点。能积累生育酚的微藻有螺旋藻、杜氏藻、集胞藻、绿藻等［4］。菌种中研究最广泛的是裸藻，其生育酚浓度为每克细胞中1.12～7.35mg。研究发现纤细裸藻有最高的生育酚生产力［5］;并且能获得高密度细胞，是少数几个能同时生产β胡萝卜素、维生素C和维生素E的微生物之一［6］，其合成的生育酚超过97%是α型，没有细胞壁，可以很容易地提取生育酚。与其他微生物相比，裸藻有很好的开发潜力和发展前景，所以主要讨论这种光合细菌。

为了大量合成而对植物和微生物进行了基因工程和代谢工程。分析生育酚合成的原理和反应，已经克隆了5个酶的基因并做了功能鉴定，这些基因将利于我们在分子和生化水平上研究和操作VE合成。依据表达的酶在合成中的作用将这些基因分成两类:一类主要提高VE总量，另一类主要影响VE成分。正常培养条件下，微生物积累的超过90%是α－生育酚，因此，微生物的基因工程应旨在增加VE总量。

VE的芳香性前体是尿黑酸和对羟基苯丙酮酸，合成对羟基苯丙酮酸是植物积聚VE的限制性步骤。通过表达烟草植物里的预苯酸脱氢酶基因和过表达拟南芥的对羟基苯丙酮酸二加氧酶HPPD序列，在预苯酸水平上合成VE，这能高度积累生育酚［7］。玉米种子中HGGT的过表达使生育酚和生育三烯酚增加了6倍［8］，并采用分子标记辅助作用。多种途径旨在增加植物中VE总量。

高等植物基因或代谢工程的研究很多，而微生物的研究很少。集胞藻属中的蓝藻菌株PCC 6803具有进行基因工程良好的特点。诱导表达HPPD基因时，总VE增加了5倍。但是没有高生育酚生产者的基因修改报告。

叶绿体缺陷纤细裸藻W14ZUL菌株中增加有机碳源能增加线粒体的活性、活性氧浓度和α－生育酚的生产力。野生型裸藻Z的异养培养中，活性氧的产生与α－生育酚的生产力之间正相关。因此，其最优化培养条件必须控制这些因素;而且，适合细胞生长的条件不一定适合积聚生育酚。

光似乎是影响生育酚生产的最重要因素，光强度和生育酚积聚存在正相关性。连续光照比光暗循环积聚的生育酚多，叶绿体和线粒体都参与了生育酚的合成，Kusmic等人说缺少叶绿体的裸藻中光都能促进生育酚合成。细胞器的相对贡献依赖于培养条件，培养基的组成也会影响生育酚合成。

3 培养系统

3.1 光合自养培养

光合自养是培养光合作用微生物最普遍的方法。光合自养污染危险小时，α－生育酚的积聚量很高;但在生长晚期细胞开始死亡和溶解，异养生物引起污染。光合自养培养时，限制细胞生长和α－生育酚积聚的主要问题是光照的供给(数量、质量和分布)。太阳光作为唯一光源时，细胞量和生育酚积聚主要取决于天气条件。光照时间依赖于位置和时期，它可能很短，故大部分时期培养受光照限制，生育酚积聚很低。现已发明整合太阳光和人造光来持续照明。当太阳光强度降到设定值时，系统自动从太阳光转为人造光。纯光合自养适用于小规模α－生育酚生产，它操作简单，投资和运营成本低，但其生产力和生物量很低，不适合商业在生产。

3.2 异养培养

裸藻和其他微生物(如绿藻、衣藻等)在缺少光照条件下能利用有机碳进行异养生长，虽然异养生长的裸藻生育酚含量比光合自养低，但异养生物反应器也可以生产生育酚。通过优化有机碳源和通气量条件，可以得到高浓度细胞和生育酚含量。由于光能成本高和反应器内部光分散的技术问题，异养培养商业化生产生育酚可能性很高［9］。

3.3 光能异养培养

光合自养培养时细胞浓度低、生育酚浓度高，异养培养则相反，光异养培养能同时获得高浓度的细胞和生育酚。光异养培养中，光合自养和异养的代谢活动之间存在相互作用。葡萄糖作为裸藻的有机碳时，低光强度下光合自养和异养代谢活动同时独立进行，因此光异养培养的生长速率和最终细胞浓度值是两者的加和。然而，高光照强度抑制了光合作用和葡萄糖的吸收，导致细胞浓度降低，但生育酚浓度却很高。说明异养代谢对光抑制作用的敏感性高于光合自养。裸藻进行光异养培养时，适合细胞生长的条件与利于α－生育酚积聚的条件不同。细胞的生长受有机碳吸收的控制，而α－生育酚积聚则受光合自养代谢的控制。为得到高浓度的细胞和α－生育酚，应调节两种代谢活动的比例。光合自养对细胞生长的贡献会随着光强度、通气中CO2浓度的增加和有机碳源供料速度的降低而增加。限制有机碳使代谢平衡转移到光合自养上。若有机碳过量，就算在高光强度下α－生育酚量也很低。微生物培养可以利用许多有机碳，如乙醇、乳酸和半乳糖等可以有效地积聚α－生育酚，葡萄糖和果糖则有利于细胞的生长，且混合基质比单个有效［10］。

裸藻光异养培养积聚α－生育酚的潜能很高。可以获得相当高的生产力，且光合作用产生的氧被有机碳吸收，同时碳同化释放的二氧化碳被光合作用利用。

3.4 相继的异养—光合自养培养

在光能异养培养中，适合有机碳吸收的条件与生育酚积聚的条件不同。为了得到最高容量的生育酚生产率，优化培养系统时必须在两者之间做出妥协。从光合自养活动中分离有机碳，吸收作用可以避免这一问题，分别优化它们。在异样培养条件下，纤细裸藻Z生产的细胞量比光能自养条件多，但维生素却相对较少。为增加VE量，应用两步培养，即先将细胞在异养条件下培养，然后转移到自养下继续培养。实验结果表明，在高细胞密度下利用两步培养，纤细裸藻的VE生产能力有了明显提高。异养末期获得的细胞浓度取决于光合自养阶段光的提供。在有机碳类型、浓度、通气量、培养基成分和流体力学压力方面来优化异养阶段;另一方面，在初始细胞浓度、光强度和分布、CO2供给、培养基组成等方面优化光合自养。传统的异养生物反应器，在异养阶段能够保持单一培养，开放池塘中进行的光合自养，污染也不是个严重问题;因为它细胞浓度高、培养期限短且缺少有机碳。

3.5 循环的光合自养—异养培养

光生物反应器照明的能耗很高，且太阳光不稳定，每天只有不到6h的有效光适合光合作用细胞生长。黑暗条件下，细胞不能生长，还消耗有机碳，使细胞浓度降低。循环性光合自养—异养培养能解决这个问题，它使有机碳量在晚上增加，可以获得光、暗循环下连续生长的细胞［11］。为了获得最大生产率，须选择合适的有机碳源，且添加恰好的量使没有剩余的有机碳转入到光周期里。当葡萄糖作为有机碳时，在异养阶段的夜里，α－生育酚的浓度会降低，但会在光合自养阶段恢复。但用乙醇时，α－生育酚的浓度在这两个阶段会保持稳定。光合自养阶段若只利用太阳光，光强度波动会影响α－生育酚的量。使用太阳光、人造光和有机碳供给的整合系统［12］，光源在光亮时为太阳光，阴天时自动会转为人造光。确保了光合自养阶段稳定的光供给，相同培养条件下α－生育酚的量是纯光合自养的5倍。

4 光生物反应器

光生物反应器包括开放培养系统(如自然水域、人工池塘等)和封闭光生物反应器(如管状光生物反应器、平板光生物反应器等)。传统海洋微藻多采用开放式培养系统，存在培养条件难以控制、生产周期受季节限制、易受污染等不可克服的缺点［13］。管状光生物反应器转移量低，异养代谢很难维持无菌条件，故也不适合。

光生物反应器应当设计成平板或垂直塔形状的。相对长的光途径(＞50cm)或者局部阴影能使细胞生长和α－生育酚积聚之间保持良好平衡。平板式光生物反应器具有高液体循环速度和较小的光衰减度，更利于藻体细胞对光的吸收，操作简单、容易放大，适合于微藻的规模化高密度培养。

5 未来展望

VE具有显著的生理活性，是人类生命活动中不可缺少的物质。近年来，微藻合成VE已成为研究的热点。微藻工业化生产VE要考虑很多因素，有经济成本、污染问题、培养系统、培养装置、光源和有机碳源等。目前还不能用裸藻大规模生产生育酚，今后研究分析生物学、基因工程、光生物反应器和微生物培养中的成熟技术和设备，利于调控和优化培养，易于规模放大，势必会加快微藻及其产品的产业化进程。

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Progress of Industrialization Development of Microorganism Vitamin E

ZHANG Shan－Shan
(College of Chemical Engineering，Qingdao University of Science and Technology，Qingdao 266042，China)

TQ466.5

A

1003－3467(2011)03－0032－03

2010－10－26

张姗姗(1987－)，女，硕士研究生，从事药物与生物工程研究，电话:13791913034。