液相色谱－电喷雾离子肼质谱联用法在体内药物分析中的应用＊

陈琴华，朱 军，李 鹏

(湖北医药学院附属东风医院药学部，湖北 十堰 442008)

面对成分越来越复杂的分析样品，以及痕量甚至超痕量水平的目标分析物，如何能快速、准确地获取目标分析物的信息，是样品分析技术研发领域中一个重要的环节。近几十年来，体内药物分析技术经历了常规分析、光谱法分析、色谱法分析、色谱－质谱联用法分析等发展阶段，不断推动着药物代谢研究的发展[1]。高效液相色谱－电喷雾离子阱串联质谱(HPLC－ESI/MSn)法是近年来迅速发展的一项高灵敏度、高专属性、快速简便的在线分离和检测分析技术，适用于生物样品的定性、定量分析，是药物代谢物结构分析最有效的测定方法之一。HPLC－ESI/MSn可在一级质谱(MS)条件下获得很强的待测物准分子离子峰，几乎不产生碎片离子，并且可借助MSn(n=2～10)对准分子离子进行多级裂解，进而获得丰富的结构信息，因此其在生物样品中的分析应用越来越广泛[2－3]。

1 概述

20世纪20年代，质谱技术已广泛应用于分析领域。到了80年代，随着快原子轰击(FAB)、电喷雾(ESI)和基质辅助激光解析(MALDI)等软电离技术的出现，质谱的分析性能得到了极大提高，离子阱质谱仪是目前较成熟的质谱仪之一，其主要优点是能够方便地进行多级串联质谱(MSn)测量[4]。离子阱具有贮存离子和质量分析功能，这决定了它具有离子－分子反应很好的功效，离子阱中母离子与子离子共存，减少了传输损失，可更有效地检测离子。离子阱作为串联质谱具有碰撞活化解离(CID)和激光解离(PD)功能，现在越来越多地应用于化学分析领域中[5]。

HPLC－ESI/MSn结合了液相的高分离性能与作为检测器的质谱仪(MS)的高选择性、高灵敏度，成为目前生物样品中微量药物和代谢物分析的实用方法[6]。许多化合物在中性环境中以中性分子被分析，然而，如果在有利于离子形成的情况下，其他化合物也能在有较高的灵敏度下分析。当分析物溶解在酸或碱这样的极性溶剂中时，它可被离子化或具有强的偶极矩。对于电离的分析物，电喷雾通常简单且具有高灵敏度，不存在其他离子－离子相互作用的干扰，离子在喷雾之前已存在于溶液中，在喷雾中这些离子易从液滴中蒸发出来，得到较高的分析物离子丰度。形成强偶极矩但没有被电离的分析物也可被分析，喷雾室中的强电场驱动离子化过程，通过使用特定化学物质的加合作用，这些分析物也可被化学电离[3－5]。

适合于电喷雾的样品包括：含杂原子的样品；通过引入可接受1个电荷的样品；在溶液中能形成多电荷的样品；在溶液中能形成离子的样品；适用于热喷雾的样品；当不能引入电荷时，避免极其非极性的样品。电喷雾离子形成步骤包括：溶液中的电离(样品的pKa和溶液的pH)；喷雾(表面张力、黏度和气动辅助)；去溶剂(干燥气温度、流速和热容量)；离子从溶液中解吸(溶解能)；气相中的离子化反应(质子亲合力和电荷交换)。电喷雾离子化的影响因素有：溶液的化学性质(流速、样品pKa、溶液pH和溶液的导电性)；针的设置(内部针的位置、针的状况和喷雾压力)；高电压电极(毛细管和喷雾室电压设置、毛细管和喷雾室高压条件以及绝缘体的条件)。离子检测极性和pH选择的规则，正离子检测为碱性样品；降低pH；pH至少低于样品pKa2个单位。负离子检测为酸性样品；增加pH；pH至少高于样品pKa 2个单位。

2 应用

药物分析中，通过体内(体液和组织)药物的检测可以了解给药后药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄的情况，为药物的药效、毒性评价及其在体内作用的机制研究提供信息。HPLC－ESI/MSn可使样品的分离、定性和定量一次完成，并且灵敏度高，是药物分析尤其是体内药物分析的一个重要手段。HPLC－ESI/MSn在体内药物分析中应用较广泛，主要涉及到化学药物的血药浓度测定和代谢产物鉴定、兴奋剂和甾类的测定和鉴定，磷脂类药物的测定、中药活性化合物的测定和代谢产物的鉴定，以及其他如孔雀石绿、结晶紫和农药在体内的残留测定。见表1。

表1 HPLC－ESI/MSn在体内化学药物分析中的应用

化学药物的测定中，利培酮[7]、伊曲康唑[9]、伪麻黄碱、西替利嗪[16]和布比卡因[17]均采用选择监测离子监测，为了提高灵敏度和专属性，大多采用MS2离子监测，如利培酮 m/z411→191和伊曲康唑 m/z 705.3→432.1，其检测限分别达到0.1 ng/mL和1.0 ng/mL。对乙酰甲喹[8]、阿奇霉素[12]和莫西沙星[13]等进行代谢物鉴定时，一般采用全离子扫描方式(SCAN)，并且可发挥离子肼质谱的优势，采用一级全扫描(MS1)、二级全扫描(MS2)、多级全扫描(MSn)与一级选择离子监测、二级选择离子监测、多级选择离子监测相结合来鉴定相关代谢产物。

HPLC－ESI/MSn综合了液相色谱和质谱的优点，弥补了各自的缺陷，因而具有灵敏度高、分析速度快和鉴别能力强的特点，可同时完成待测组分的分离和鉴定，特别适用于多组分混合物中未知组分的定性和定量分析，判断化合物的分子结构，准确地测定化合物的分子量，是目前能够为pg级试样提供结构信息的工具。因此，HPLC－ESI/MSn可用于滥用药物分析，主要包括毒物和精神类药物，在毒品检验、戒毒工作方面具有独特的优势，可用于测定生物样品和体液中药物和代谢物的痕量分析。如可卡因、苯甲酰芽子碱和阿片制剂的测定[22]。根据国际奥委会医学委员会的要求，体育运动中的兴奋剂检测能用作确认的仪器是气相色谱－质谱联用和液相色谱－质谱联用。一般兴奋剂检测实验室都以气相色谱－质谱做初筛，一般用选择离子检测(SIM)即有较高的灵敏度，初筛有怀疑的样品必须重新进行检测，并用样品与同样条件下比对物全扫描质谱图的一致性、保留时间的一致性对检测物质进行定性，而离子肼质谱具有多级解离和裂解功能，可对确证这类化合物提供有利的帮助。如皮质激素类药物、麻黄碱、沙丁胺醇和吗啡[21]以及甾类药物的分析[23]。

电喷雾是常见的软电离质谱技术，电喷雾离子阱质谱检测为天然产物的成分分析提供了简便、灵敏的方法。一方面，软电离技术不会破坏天然产物的结构；另一方面，强大的MSn功能可以反复筛选目标离子，排除其他干扰离子，结合MSn的离子源碰撞诱导解离可从化合物的断裂规律初步解析天然产物的结构和中药活性化合物的代谢产物。如对水苏碱[22]、大豆黄素[26]和药根碱[27]等的研究均采用了MSn分析，确认其代谢途径和相关代谢产物。其他还可运用如对鱼肉中孔雀石绿和结晶紫[33]和人血浆中大量农药残留的研究[34]。

3 展望

基于质谱的代谢组学分析，主要采用液相色谱－质谱联用技术(LC－MS)和气相色谱－质谱联用技术(GC－MS)。气相色谱－质谱联用技术虽因具有解析能力强、灵敏度高、拥有成熟的商业化质谱数据库等多方面优势，在代谢组研究中得到一定的应用，但在代谢组学分析中的主要对象为血清、尿液等体液和组织匀浆液，这些生物样品在分析前需要预处理，包括蛋白沉淀、代谢物提取等步骤。由于氨基酸、有机酸等重要的内源性代谢物挥发性较弱，且具有热不稳定性，必须进行衍生化后才能运用气相色谱－质谱联用技术分析。而液相色谱－质谱联用技术不需要衍生化，适合分离测定大部分化合物，应用前景会越来越广泛。高效液相色谱－质谱联用技术已成为目前生物样品中微量药物和代谢物分析的常用方法。离子阱能方便地进行多级串联质谱测量，从而获得丰富的结构信息，具有不可比拟的高灵敏度和选择性。因此，HPLC－ESI/MSn在药物代谢产物的鉴定方面应用会越来越广泛。

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