三维Ag/ZnO中空微球的制备及其抗菌性能

卢伟伟，宋应利，张 军，王键吉

(河南科技大学化工与制药学院，河南洛阳471003)

0 前言

纳米无机抗菌剂与传统的有机抗菌剂和块状无机抗菌剂相比，具有稳定性好、安全性能高、抗菌谱广、效果持久、所需用量少等众多优点。近年来，在众多的无机抗菌剂中，Ag纳米粒子以及Ag+离子的抗菌性能已经被广泛研究和应用［1－7］。但在抗菌方面，单质Ag纳米粒子有别于Ag+离子，单质Ag纳米粒子的抗菌活性受到其粒径的影响极大，即粒径越小，其抗菌活性越高［2，7］。然而，随着粒径的减小，表面能的增加，Ag纳米粒子非常容易团聚，从而使其抗菌性能大大降低。同时，为了更经济的使用贵金属Ag，也需要寻找一种既不损害其功能又高效的方式来分散Ag纳米粒子。基于这种目的，Ag纳米粒子被担载于SiO、分子筛［9］以及碳纤维［10］等载体上来使用，然而这些载体却没有抗菌活性。而制备成本较低的ZnO作为另一种优良的无机抗菌剂，可以作为Ag纳米粒子的良好载体，从而形成Ag/ZnO复合材料应用于纳米抗菌研究。

本文在生物高分子海藻酸钠的辅助下，采用水热合成的方法制备了具有三维分层超结构的Ag/ZnO中空微球，利用场发射扫描电镜、高分辨透射电镜和光电子能谱等手段对其结构进行了表征，最后对其抗菌性能进行了研究。

1 试验部分

1.1 三维Ag/ZnO中空微球的制备

海藻酸钠购买自Acros，其他所有试剂均购自北京化学试剂有限公司。三维Ag/ZnO中空微球的制备过程如下:将1.5 mmol乙酸锌和适量硝酸银溶解于20 mL水和10 mL乙醇的混合溶剂中，在磁力搅拌下，向上述溶液中加入0.55 mL、25.4 mmol/L的海藻酸钠水溶液，然后再逐滴加入1.0 mL质量分数为28%的氨水，搅拌10 min左右转移到50 mL聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，旋紧釜盖，置于烘箱中393 K下恒温反应8 h。反应结束后，取出反应釜，自然冷却至室温，所得产物经离心分离，并用去离子水和乙醇洗涤数次，最后自然晾干，得到粉末状的Ag/ZnO样品。

1.2 样品的表征

样品形貌的FESEM观察在Hitachi S-4800场发射扫描电子扫描显微镜上进行。样品的TEM和 HRTEM表征分别在Hitachi H-800低分辨透射电镜及JEOL 2100高分辨透射电镜上进行。样品的表面性质及氧化态通过X射线光电子能谱在PHIQuantum 2000型XPS探针仪上进行表征。以各个样品中的烃基污染物中C 1s作为内标矫正样品中其他各元素的绝对电子结合能。样品表面的实际Ag含量通过灵敏度因子法进行计算。

1.3 抗菌性能测试

通过两种方法测定样品的抗菌性能:纸片扩散法(改性的Kirby-Bauer技术)和最小抑菌浓度(MIC)法。

1.3.1 定性的纸片扩散法

将蘸有ZnO或Ag/ZnO样品(直径大约5 mm)的圆形纸片置于事先接种的琼脂平板中，于37℃培养24 h后取出观察抑菌圈的大小。

1.3.2 定量MIC分析

称取不同量的Ag/ZnO样品倒入盛有20 mL LB培养液的三角烧瓶中，盖上透气棉塞放入灭菌锅中处理后，冷却。然后，于上述三角瓶中分别接种200μL(浓度为每毫升细菌菌落数为108个)的菌液，在振动摇床上恒温35℃振荡16 h。最后，取等量的溶液经梯度稀释后，分别涂于固体LB培养基上，采用平板计数法计算活菌数(取3个平板的平均值)。能够抑制细菌生长的最小样品浓度定义为此样品的最小抑菌浓度值(MIC值)。每个样品做3次平行，MIC值取其平均值。

2 结果与讨论

2.1 Ag/ZnO中空球的晶体微观结构

所制备的Ag/ZnO样品的FESEM表征如图1所示。从图1a和图1b所示的SEM电镜照片可以看出:样品整体上呈3～5μm的球形。图1c显示了一个破碎微球的一部分，从图1c可以看出:微球为中空，其球壁是由直径约100 nm、长度约1μm的纳米棒定向排列组成。而从图1d可以看出:微球表面并非光滑的，看到的为定向排列的纳米棒的顶端。

图1 Ag/ZnO中空微球的FESEM图

图2所示为对Ag/ZnO样品所做的TEM和HRTEM分析。图2a所示的破碎微球某部分的TEM图确认了在FESEM观察中得到的结论，即Ag/ZnO中空微球的球壁是由定向排列的纳米棒组成的。图2b所示的TEM图为散落于铜网上的某几根Ag/ZnO纳米棒，其中，ZnO和Ag的高分辨的二维晶格透射像分别如图2c和图2d所示。图2c中均匀的二维晶格条纹说明了ZnO的高度结晶性，其＜0001＞方向的晶格间距约为0.528 nm，近似等于六方晶系ZnO(0001)晶面的面间距，这说明ZnO是沿着＜0001＞方向择优生长的。结合图2a可知:所有组成微球的ZnO纳米棒都是沿着其生长方向垂直于微球表面而定向排列的。从图2d的HRTEM图还可以观察到多晶态Ag纳米粒子的不均匀晶格条纹，这也说明了所制备的样品是由金属Ag和半导体ZnO所组成的复合材料。

图2 样品的TEM和HRTEM图

为了进一步考察所制备Ag/ZnO中空微球的表面性质，样品进行了XPS分析。样品中元素的电子结合能都采用污染烃的C 1s峰(标准值284.6 eV)进行了矫正。样品的XPS全谱和Ag 3d能级的XPS窄谱如图3所示。图3a显示了纯ZnO和Ag的质量分数为2.13%的Ag/ZnO样品的XPS全谱，通过对比可以发现:Ag的峰仅出现在Ag/ZnO样品中。Ag/ZnO样品的Ag 3d XPS曲线如图3b所示，作为对比，所制得的纯Ag的XPS谱也同样列出。通过比较可以发现:Ag的质量分数为2.13%的Ag/ZnO样品中Ag电子结合能向低位移动，这表明在Ag/ZnO体系中，金属Ag向半导体ZnO转移电子，导致了Ag的电子密度减小而使Ag纳米粒子带部分正电荷。

图3 样品的XPS图谱

2.2 样品抗菌性能的研究

图4 ZnO和Ag/ZnO抑菌作用的定性纸片扩散法实验照片

许多的文献已经报道Ag纳米粒子具有强的抗菌作用［1－2］，然而由于纳米Ag易于团聚，这大大降低了其抗菌性能。为了解决这个问题，在研究中，Ag纳米粒子被担载于ZnO上。除此之外，由于纳米Ag和ZnO纳米棒之间存在强的相互作用，在形成Ag/ZnO复合材料后，它们可能协同地发挥抗菌作用。本文考察了所制备的Ag的质量分数为2.13% 的Ag/ZnO样品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能。样品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌作用，分别做了纸片扩散的定性分析和测定MIC值的定量分析。定性的纸片扩散法得到的样品抑菌圈的照片如图4所示，从图4中可以看出:对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，Ag/ZnO样品的纸片周围都有明显的抑菌圈产生。这表明Ag/ZnO不仅对格兰氏阴性细菌而且对格兰氏阳性细菌也具有抗菌活性。

为了更进一步考察样品的抗菌性能，对Ag，ZnO和Ag/ZnO的MIC值进行了测定，其结果列于表1中，实验结果表明:Ag的质量分数为2.13%的Ag/ZnO样品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值分别为600μg/mL和400μg/mL。如以Ag的量来计算，则Ag的质量分数为2.13%的Ag/ZnO样品对大肠杆菌抑菌值仅为12.8μg/mL，而对金黄色葡萄球菌则仅为8.5μg/mL。从表1中还可以看出:Ag纳米粒子的MIC值对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别为15μg/mL和25μg/mL;纯ZnO的MIC值对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别为3 500μg/mL和1 000μg/mL。因此，从实用性和经济性来说，Ag的质量分数为2.13%的Ag/ZnO微球的抗菌性能要远远高于纯的Ag和ZnO。

表1 Ag，ZnO和Ag/ZnO样品的最小抑菌浓度(MIC)值

从表1的数据可以看出:尽管Ag和 ZnO都具有抗菌活性，但它们对G－和G+细菌的抗菌效果不同，Ag对G－细菌的抗菌性能要好于对G+的抗菌性能，而ZnO则对G+的抗菌性能较好。这种现象分别在有关Ag［1］和ZnO［11－12］的抗菌文献中有过报道。因此，当Ag和ZnO结合形成Ag/ZnO复合材料时，Ag/ZnO同时对G－和G+细菌表现出了优异的抗菌性能;并且Ag/ZnO的抗菌效果并不是Ag和ZnO抗菌效果的简单相加而是相互协同加强的。

一方面，ZnO纳米棒作为载体减少了Ag纳米颗粒的团聚，从而使Ag纳米粒子有更多的机会接触细菌的细胞壁并和其中含有S和P的化合物反应。已有文献报道显示:Ag纳米粒子和细胞壁的这种相互作用，将影响细胞壁的渗透性和呼吸性能等而最终导致细菌的死亡［2，6］。另一方面，Ag纳米粒子和细菌之间的静电相互作用，在抗菌过程中也起到很大的作用［1－2］。在细菌存活的正常pH值，由于细胞壁上大量含羧基和其他基团化合物的脱落溶解，细菌表面总体上呈电负性［12］。并且由于体系中电子从金属Ag转移至ZnO，因此Ag/ZnO复合材料中的Ag纳米粒子和纯Ag纳米粒子相比具有很强的电正性。所以，正是由于Ag/ZnO中金属Ag和半导体ZnO的这种相互作用，导致了正电性的Ag和负电性的细菌之间静电作用的加强，从而提高了Ag/ZnO的抗菌性能。

3 结论

本文采用水热合成的方法制备了Ag含量不同的三维Ag/ZnO中空微球，对其结构进行了表征和抗菌性能的研究，结构表征结果说明:所制的样品为直径3～5μm的中空微球，其球壁是由直径约100 nm，长度约1μm的Ag/ZnO纳米棒沿着其生长方向并垂直于微球表面的定向排列所组成。这种新颖独特的自组装三维分层超结构的Ag/ZnO复合材料的形成，一方面有效解决了Ag纳米粒子和Ag/ZnO复合纳米棒在溶液中的团聚问题，而使所制备材料的抗菌性能大大提高;另一方面，由于Ag对格兰氏阴性细菌的抑制作用较强，而ZnO对格兰氏阳性细菌的抑制作用较强，而使Ag/ZnO复合材料表现出协同的高效抗菌性能。

［1］ Shrivastava S，Bera T，Roy A，et al.Characterization of Enhanced Antibacterial Effects of Novel Silver Nanoparticles［J］.Nanotechnology，2007，18(22):5103－5111.

［2］ Morones J，Elechiguerra J，Camacho A，et al.The Bactericidal Effect of Silver Nanoparticles［J］.Nanotechnology，2005，16 (10):2346－2353.

［3］ Aymonier C，Schlotterbeck U，Antonietti L，et al.Hybrids of Silver Nanoparticles with Amphiphilic Hyperbranched Macromolecules Exhibiting Antimicrobial Properties［J］.Chemical Communications，2002，24:3018－3019.

［4］ Oyanedel C，Smith J.Sustainable Colloidal Silver Impregnated Ceramic Filter for Point of Use Water Treatment［J］.Environmental Science＆Technology，2008，42(3):927－933.

［5］ GogoiS，Gopinath P，Paul A，etal.Green Fluorescent Protein-expressing Escherichia coli as a Model System for Investigating the Antimicrobial Activities of Silver Nanoparticles［J］.Langmuir，2006，22(22):9322－9328.

［6］ Baker C，Pradhan A，Pakstis L，et al.Synthesis and Antibacterial Properties of Silver Nanoparticles［J］.Journal of Nanoscience and Nanotechnology，2005，5(2):244－249.

［7］ Siekkinen A R.Synthesis of Silver Nanoplates at High Yields by Slowing Down the Polyol Reduction of Silver Nitrate with Polyacrylamide［J］.Journal of Materials Chemistry，2007，17(25):2600－2602.

［8］ Yoon K Y，Byeon JH，Park CW，et al.Antimicrobial Effect of Silver Particles on Bacterial Contamination of Activated Carbon Fibers［J］.Environmental Science＆Technology，2008，42(4):1251－1255.

［9］ Yamamoto O，Nakakoshi K，Sasamoto T，etal.Adsorption and Growth Inhibition of Bacteria on Carbon Materials Containing Zinc Oxide［J］.Carbon，2001，39(11):1643－1651.

［10］ Sawai J.Quantitative Evaluation of Antibacterial Activities of Metallic Oxide Powders(ZnO，MgO and CaO)by Conductimetric Assay［J］.Journal of Microbiological Methods，2003，54(2):177－182.

［11］ Thiel J，Pakstis L，Buzby S，et al.Antibacterial Properties of Silver-doped Titania［J］.Small，2007，3(5):799－803.

［12］ Stoimenov PK，Klinger R，Marchin G L，et al.Metal Oxide Nanoparticles as Bactericidal Agents［J］.Langmuir，2002，18 (17):6679－6686.