食管癌前病变与食管腺癌细胞DNA倍体变化分析

孙剑经，逯 海，张 斌

（1．河北北方学院附属第一医院消化内科，河北 张家口075000；2．河北北方学院附属第一医院检验科，河北 张家口075000）

食管癌前病变与食管腺癌细胞DNA倍体变化分析

孙剑经1，逯 海1，张 斌2

（1．河北北方学院附属第一医院消化内科，河北 张家口075000；2．河北北方学院附属第一医院检验科，河北 张家口075000）

目的 探讨慢性炎症－癌前病变－食管腺癌不同阶段的食管黏膜细胞DNA含量及倍体变化，从细胞代谢水平揭示食管癌的发展过程．方法 用流式细胞术对15例检查未见器质性病变者的正常组织，27例胃食管反流病患者 （GERD）、25例Barrett食管患者和31例食管腺癌患者的病变组织细胞DNA含量进行了检测，并对四组的DNA倍体类型、DNA指数 （DI）、G2／G1、增殖活性 （SPF）和细胞增殖活性指数 （PI）做了对比分析．结果 食管腺癌22例DNA含量全部为非整倍体变化 （DNA指数DI＞1．1），Barrett食管25例中仅6例为非整倍体DNA含量，胃食管反流病和健康者无1例为非整倍体DNA含量；食管腺癌组G2／G1、SPF、PI较正常组织和胃食管反流病组均有明显升高 （P＜0．05），Barrett食管组介于胃食管反流病与食管腺癌之间，并且G2／G1、SPF和PI指标差异均有统计学意义 （P＜0．05）．流式细胞术诊断阳性率差异显著．结论 食管癌的发展是一个渐进的过程，各阶段之间密切相关．

食管腺癌；癌前病变；DNA含量；倍体变化

食管癌的发生从慢性炎症 （胃食管反流性疾病）→腺上皮化生 （Barrett食管）→重度不典型增生→原位癌→食管癌，是一个多阶段渐进过程．Barrett食管 （BE）作为一种癌前病变，是食管腺癌的高危因素．用流式细胞术对恶性肿瘤组织生物学特性的研究已获得了大量有重要价值的成果［1－4］．应用流式细胞术 （flow－cytometry，FCM）对胃食管反流性疾病 （GERD）、Barrett食管 （BE）及食管腺癌细胞核DNA含量进行定量检测分析，以探讨BE上皮细胞核DNA含量及细胞增殖周期各时相分布规律，从细胞及细胞代谢水平揭示BE与食管腺癌的关系，分析研究食管癌发生发展机制．

1 材料和方法

1．1 标本来源

选取2008．02．01—2010．04．30在河北北方学院附属第一医院消化科就诊的门诊及住院患者共98例．其中正常食管15例 （作为二倍体标准细胞），GERD 27例，BE 25例，食管腺癌31例．正常组织、GERD及BE细胞标本均由胃镜活检所取，食管腺癌31例中有21例为病理科石蜡包埋块．正常食管取材时除外食管炎症、溃疡狭窄及肿瘤，24h食管内pH监测阴性．胃食管反流病者均有GERD临床症状，pH监测显示过多酸反流．BE为食管Z线上方2cm以上或食管下括约肌3cm以上的桔红色类似胃粘膜的粘膜处取材，均伴有不同程度的食管下段或中下段黏膜充血、水肿、糜烂，病检证实为柱状上皮化生者．组间性别构成及年龄差异均无统计学意义，P＞0．05，未予单独统计．

1．2 细胞悬液制备和测定

获取标本后立即用搓网法制成单细胞悬液，用流式细胞术对样本进行DNA含量分析［4－6］：①将内镜下获取的黏膜组织剪碎，以100目滤膜过滤，调整细胞浓度约1．0×106个／mL；②加入碘化丙锭 （PI）综合染色液 （美国BD公司产品）1．0mL，置4℃30min；③上流式细胞仪 （美国BD公司FACS calibur型）分析，先以鸡红细胞的DNA含量作为外参考标准，每份标本用BD公司提供的Cellquest软件获取2．0×104个细胞，再用Modfit LT 2．0软件程序分析细胞的DNA含量．

1．3 主要检测指标及计算方法

①DNA指数 （DNAindex，DI）：根据1984年国际分析细胞学会名词审定委员会及1990年第14届国际分析细胞学学术会议的决定，以正常组织内二倍体细胞做内标，确定样本细胞的DI值，表示DNA含量．②以正常细胞DNA含量G0／G1细胞的峰道值为二倍体细胞的标准 （DI＝1．0）．DI＝被测细胞峰（G0／G1）均道值／正常细胞峰 （G0／G1）的均道值．DNA倍体的判断标准为0．9≤DI≤1．1为二倍体细胞，DI＞1．1为异倍体细胞．③G2和G1期细胞比率 （G2／G1）．④细胞增殖活性：即S期细胞比率 （S－phase frac－tion，SPF），SPF （%）＝ ［S÷ （G0／1＋S＋G2＋M）］×100%．⑤细胞增殖活性指数 （PI），PI＝（S＋G2＋M）／ （G0／1＋S＋G2＋M）×100%．

1．4 流式细胞术诊断标准

根据Kelein［7］确定的流式细胞诊断为阳性：①发现DNA非整倍体峰诊断为阳性；②如无明显整倍体峰，但有1个突出的四倍体细胞峰和＞15%的超二倍体 （S期）细胞，伴有G0／G1峰的变异系数 （CV）＞9%诊断为阳性；③无明显非整倍体细胞组G0／G1峰CV值增大并伴有＞10%～15%的超二倍体细胞和1个突出的小倍体峰位，诊断为可疑癌．

1．5 仪器及样本分析

流式细胞仪为美国Becton Dickison流式细胞仪 （FACScalibur型）．采用BD公司提供的Cellquest软件，每份样本获取2．0×104个细胞，DNA含量各种参数采用该公司提供的 Modfit LT 2．0软件进行分析．

1．6 统计学分析

由SPSS8．0软件包进行数据统计，对资料采用t和χ2做差异显著性检验，P＞0．05为差异无显著性，P＜0．05为差异有显著性，P＜0．01为差异有非常显著性．

2 结 果

2．1 倍体类型比较

如表1所示，15例未见器质性病变者的正常组织和27例胃食管反流病患者的病变组织均为二倍体细胞，DI值为1．00±0．00，各种正常组织之间差异不显著 （P＞0．05）；25例Barrett食管患者中6例出现DNA异倍体细胞，DI值为1．08±0．23，31例食管腺癌患者全部出现DNA异倍体细胞，DI值为2．76±0．73 （P＜0．05）．

2．2 细胞增殖活性指标

食管腺癌组G2／G1、SPF、PI较正常组织和GERD组均有明显升高 （P＜0．05），说明食管腺癌细胞DNA含量增高，G2期、S期比例明显升高，而Barrett食管组各项指标介于二者之间．

表1 正常组织、GERD、Barrett和食管腺癌组织细胞增殖活性指标比较

2．3 流式细胞术诊断阳性率

正常组织和GERD组阳性率为2．1%；Barrett食管组16例，阳性率为64%；食管癌组阳性28例，阳性率为90．3%．食管癌组阳性率较前两组明显为高，χ2＝46．71，P＜0．01．

3 讨 论

食管腺癌作为食管恶性肿瘤其发病率大幅度增加，增长速度甚至超过了食管最常见的恶性肿瘤——食管鳞状上皮癌［8］，可能与GERD和Barrett食管发病率增加有关．BE是食管腺癌最重要的危险因素，食管特殊型肠上皮化生是食管腺癌的癌前病变．目前我国食管癌的组织病理类型仍以鳞状上皮癌为主，占90%以上，食管腺癌所占比例较少，其5年生存率仍很低［9］．

检测DNA含量的变化并结合其他参数诊断癌前病变和早癌是可行的［10］．应用流式细胞检测技术分别对正常食管、GERD、BE及食管腺癌粘膜上皮细胞DNA含量及细胞增殖活性的变化进行分析，结果表明：细胞核DNA含量的变化 （非整倍体）及细胞增殖活性的变化不仅与食管腺癌有关，而且与BE有关；部分BE可出现与食管腺癌同样的DNA非整倍体含量和细胞增殖活性指标升高．说明从胃食管反流病、BE到食管腺癌的发展演变过程中，同时伴有DNA含量的变化和细胞增殖活性指标的变化．DNA含量的变化可作为BE发生癌变的一种灵敏的生物学标志．在临床上，有DNA含量异常的BE患者即被认为是具有高度癌变危险性的，应对其进行定期多次的内镜追踪观察和多部位活检，为早癌的诊断、及时的手术治疗提供理论依据．

长期而持续GERD造成鳞状上皮的损伤，柱状上皮发挥修复作用，进而取代鳞状上皮，因此Barrett食管是长期胃酸暴露和胃液返流的并发症．在BE癌变这一连续的发展过程中，非整倍体只是染色体不稳定的反应，如不加以控制，则可在肿瘤时达到顶峰．所有31例食管腺癌DNA含量均为非整倍体，而在排除腺癌的25例BE中只有6例为非整倍体．这表明，在某些BE黏膜细胞可出现染色体不稳定反应，而表现为细胞增殖活性指标升高和单个异常DNA含量．如病情继续发展，染色体不稳定反应加重，而出现多个异常DNA含量，便发生癌变［11］．依据食管腺癌发生发展变化的一般规律，积极治疗慢性炎症，早期治疗癌前病变，从而有效预防和减少食管腺癌的发生．

［1］ Salud A，Porcel JM，Raikundalia B，et al．Prognostic significance of DNA ploidy，S－phase fraction，and P－glycoprotein expression in colorectal cancer［J］．J Surg Oncol，1999，72 （3）：167－174

［2］ Molnar B，Karman J，Nemeth A，et al．Detection of aneuploidy from gastrointestinal biopsysamples［J］．Orv Hetil，2000，141 （15）：789－792

［3］ Zarbo RJ，Nakhleh RE，Brown RD，et al．Prognostic significance of DNA ploidy and proliferation in 309colorectal carcinomas as determined by two－color multiparametric DNA flow cytometry ［J］．Cancer，1997，79 （11）：2073－2086

［4］ 邵宏涛，孙丽华，谷 伟，等．DNA倍体分析在恶性胸腔积液诊断中的应用 ［J］．医学研究生学报，2000，13（6）：369－370

［5］ 周振英，朱月清，吴晓柳，等．恶性肿瘤DNA倍体分类与临床生物学行为的关系分析 ［J］．肿瘤研究与临床，2000，12 （4）230－232

［6］ 原志庆，姜红光，许春雷，等．食管鳞状细胞癌DNA倍体异质性研究及其临床病理学意义 ［J］．中华病理学杂志，1996，2 （3）：159－161

［7］ Kelein FA．Detection and follow－up of carcinoma of urinary bladder by flow cytometry ［J］．Cancer，1982，50（3）：389

［8］ Devesa SS，Blot WJ，Fraumeni JF Jr，et al．Changing patterns in the incidence of esophageal and gastric carcinoma in the United States［J］．Cancer，1998，83 （10）：2049－2053

［9］ Noguchi T，Takeno S，Takahashi Y，et al．Primary adenocarcinoma of the cervical esophagus arising from heterotopic gastric mucosa ［J］．J Gastroenterol，2001，36 （10）：704－709

［10］ Reid BJ，aggitt RC，Rubin CE，et al．Barrett’s esophagus：Correlation between flow cytometry and histology in detection of patients at risk for adenocarcinoma ［J］．Gastroenterology，1993，93 （1）：1－11

［11］ 许军英，张锦坤．食管腺癌与癌前病变的细胞核DNA ［J］．新消化病学杂志，1996，4（10）：545－547

Precancerous Lesion of Esophagus and Analysis on Ploidy Changes for Cell DNA of Esophageal Adenocarcinoma

SUN Jian－jing1，LU Hai1，ZHANG Bin2
（The First Affiliated Hospital，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，Hebei，China）

Objective To investigate the esophageal nuclear DNA content and ploidy changes of chronic inflammation－precancerous lesion－esophageal adenocarcinoma at different stages，and reveal that the development of esophageal cancer is a progressive process from view of cell metabolism．Methods For 15patients without evidence of organic lesions in normal tissue，27cases with gastroesophageal reflux（GERD），25cases with Barrett and 31cases with esophageal adenocarcinoma，flow cytometry was used to test cell DNA content，and for DNA ploidy，DNA index（DI），G2／G1，proliferative activity（SPF）and proliferation index（PI）of four groups，comparative analysis was done．Results For 22cases with esophageal adenocarcinoma，all aneuploid changes happened on DNA content（DNA index DI＞1．1）．But for Barrett esophagus，only six of 25cases had aneuploid DNA content．In the end，for gastroesophageal reflux disease and healthy objects，no aneuploid DNA content happened．Compared with that of normal tissue and gastroesophageal reflux disease groups，index of G2／G1，SPF，PI for esophageal adenocarcinoma group were significantly higher（P＜0．05）；while the index of Barrett esophagus group were between that of gastroesophageal reflux disease esophageal adenocarcinoma groups，G2／G1，SPF and PI indices were significant different，P ＜0．05；flow cytometry diagnostic produced significant differences．Conclusion Esophageal cancer development is a progressive process，and there is a strong correlation between the various stages．

esophageal adenocarcinoma；precancerous lesions；DNA content；ploidy changes

R 735．1

A

1673－1492 （2011）06－0059－03

来稿日期：2011－08－31

河北省科学技术研究发展与指导计划项目 （编号：072761678）

孙剑经（1962－），男，河北元氏人，主任医师，教授，主要研究方向：消化系统恶性肿瘤等．

李蓟龙 英文编辑：谢利锋］