促红细胞生成素对缺血再灌注损伤心肌的保护作用

吴锦波 吴平生

促红细胞生成素是由肾皮质与髓质相交处的球旁细胞等构成的一种糖蛋白类激素，具有刺激骨髓造血的功能。EPO与其受体（EPOR）结合后,刺激红系祖细胞增殖、分化、成熟,抑制其凋亡,从而增加成熟红细胞的数量。对机体供氧状况发挥重要的调控作用,可治疗各类贫血。对EPO药理机制的研究深入后发现其具备抗氧化、抗凋亡、抗炎、促干细胞迁移与促血管生成等功能[1-3]，并且对心肌缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury,IRI）有保护作用[4]。

1 促红细胞生成素的生物学特性

1.1 EPO的分子结构

EPO属唾液糖蛋白激素，是一种人体内源性化合物，分子量为34kD，循环中的EPO是由165个氨基酸残基组成[5]；由基因重组技术合成的rhEPO分子量为30.4kD。皮下注射的rhEPO生物利用度是23%～42%，静脉给予的rhEPO半衰期是4～12h。在肝脏中促红细胞生成素分子经过特异性的结合被清除[6]。

发挥EPO的生物活性的基础是29位、33位和7位、160位半胱氨酸间所形成的两个二硫键。两个二硫键破坏会丢失EPO的生物活性，烷基化半胱氨酸巯基会永久丧失EPO的生物活性[7]。

1.2 EPO的受体

人的EPO受体基因位于19号染色体短臂24区[8]，共有氨基酸残基507个和类型1跨膜蛋白域1个。前面的24个氨基酸残基为1个信号肽,另外483个氨基酸残基：236个氨基酸残基胞内域、223个氨基酸残基胞外域与24个氨基酸残基跨膜域。EPOR共有3个功能域：胞外域是EPOR的关键分化功能域，胞外域的特征是1个Trp-Ser-X-Trp-Ser近膜结构与1套半胱氨酸残基。EPOR胞内域有BOX1与BOX2保守区，没有酪氨酸激酶活性。学者提出EPOR复合体的工作模型:即EPO激活EPOR使得两个单体二聚化,以EPO结合蛋白互连，通过启动信号转导通路对细胞核内的基因表达进行调节，从而对细胞存活、分化和增殖进行调节[9]。

1.3 EPO介导信号转导

EPO没有内源性酪氨酸激酶活性却能诱导蛋白酪氨酸磷酸化。EPO分子和EPOR相结合会使得受体二聚化。附着在EPOR上的蛋白酪氨酸激酶-2分子通过与另一个蛋白酪氨酸激酶-2发生作用并被激活,接着JAK-2会磷酸化。激活的蛋白酪氨酸激酶-2分子会将EPOR胞内域的酪氨酸磷酸化,接着磷酸化酪氨酸由胞内蛋白的Src同源2区吸引到EPOR上,使得蛋白酪氨酸发生磷酸化并激活，如，信号转导和转录激活因子-5(STAT-5)等。这一系列事件导致了目标细胞发生一系列反应从G1期向S1期过渡。大约30min的EPO介导信号转导的持续后,酪氨酸磷酸化EPOR的结合位点和SH-PTP1的SH2区相结合，最终增殖信号停止。EPO介导的信号转导非常复杂，目前已经发现PI3K/Akt可能与EPO心肌保护作用有关，EPO对心肌的保护作用中的信号转导机制将会成为今后的研究重点之一。

2 EPO对心肌缺血再灌注损伤的保护作用

心肌缺血再灌注损伤会导致4类心功能的障碍，包括：①心肌顿抑，是指心脏在冠脉血流已恢复正常或接近正常后继续存在机械性功能障碍，是一种可逆性损伤，通常在数天或数周后恢复；②无复流现象，是指梗死相关冠脉再通时微血管血流遇到阻止，缺血区域不能得到有效的再灌注；③再灌注心律失常；④致死性再灌注损伤。钙反常、氧反常、炎症反应与pH反常等均可能导致心肌细胞的损伤与死亡，从而引发心肌缺血再灌注的损伤。研究已经证明，EPO及其受体在心血管系统有广泛表达[10]，通过抗凋亡、抗氧化、促血管生成、抗炎和促进干细胞的迁移等作用机制参与心肌保护。

2.1 促红细胞生成素的抗凋亡作用

心肌缺血再灌注损伤和细胞凋亡成正比，细胞凋亡是导致心肌缺血再灌注损伤的环节之一[11]。为了了解凋亡对心脏的影响，学者通过各种方法抑制凋亡过程来观察心脏结构和功能的变化，结果证明，抑制心肌细胞凋亡能够减少缺血再灌注后的心肌梗死体积几乎达到50%～70%，改善心功能。因此抗凋亡对防治心肌缺血再灌注损伤具有十分重要的意义。

在EPO抗IRI的研究中，对EPO的抗凋亡作用研究最多。通过对凋亡信号途径和EPO信号转导途径的分析，EPO在心肌缺血再灌注损伤中抗凋亡作用的可能机制为：Caspase家族蛋白酶具有半胱氨酸蛋白酶类和特异酶切Asp氨基位点两大特点，正常状态下无活性形式存在，经凋亡信号刺激后活化，被认为是凋亡过程中关键的通路，但并非是唯一的通路，凋亡的发生是一组Caspase级联反应的结果[12]。有关研究指出死亡受体/胱冬肽酶-8和线粒体/胱冬肽酶-9是心肌细胞凋亡信号转导两条主要通路，两条信号途径共有的下游通路是Caspase-3，促红细胞生成素能够阻断凋亡信号的下传途径来减少凋亡。促红细胞生成素通过和心肌细胞表面的EPOR相互结合可以起到以下作用：第一，抗凋亡蛋白上调并对促凋亡蛋白进行抑制。第二，对 Caspase酶家族进行抑制。促红细胞生成素由Bcl-XL和PKB对凋亡信号途径中的Caspase酶的激活进行抑制。PKB对Caspase-9可以直接抑制，Bcl-XL可以和Caspase-9构成多聚蛋白质复合体对Caspase-9的激活进行抑制，进而阻断凋亡信号的下传。

2.2 促红细胞生成素的抗氧化作用

王征等在离体鼠心灌注实验中发现，促红细胞生成素经过短时灌注或预处理能够抗脂质过氧化，使得氧自由基减少生成和心肌缺血再灌注损伤减轻。朱姝等以左冠脉穿线结扎法制备心肌缺血再灌注模型，造模前24h开始给予EPO腹腔注射，能增加抗氧化酶超氧化物岐化酶(SOD)活力，减低反映机体细胞受自由基攻击的严重程度的丙二醛(MDA)的含量，说明EPO预处理可以明显减轻IRI引起的氧化应激[13]。

氧化应激是心肌细胞凋亡的重要介导因素。结合抗凋亡研究，有学者提出EPO减少氧自由基生成，抗氧化的可能机制。抗凋亡蛋白能够阻止凋亡蛋白破坏线粒体，PKB能够对线粒体去极化进行阻止，这些均能够阻止线粒体内的细胞色素C的释放从而保证呼吸链的完整和线粒体的稳定，进而对氧自由基的生成进行抑制。促红细胞生成素也可以间接地减轻抗凋亡蛋白（Bcl-XL、Bcl-2等）再灌注钙的超载，使得线粒体质子增加外排和细胞钙、pH的稳态，进而保证氧自由基生成减少[14]。

2.3 促红细胞生成素的促血管生成作用

促红细胞生成素具有良好的促血管新生作用，能够使得正常血管的新生提前12～24h。促红细胞生成素既能够保持血管的内皮细胞完整性，又能够在无血管区使得血管发生进而形成新的毛细血管。促红细胞生成素的促血管新生效应也许对心功能恢复和心室的重构起到重要的保护作用。

有关研究指出促红细胞生成素可以增生血管内皮细胞，使得细胞间的质金属蛋白酶-2增加生成，并促进介导早期血管和晚期血管的生成。促红细胞生成素可以促进生成新血管的部分原因是红细胞生成素使得内皮祖细胞从骨髓中分离出来。

2.4 促红细胞生成素的抗炎作用

促红细胞生成素可以有效地减少致炎因子释放以及炎性细胞浸润，进而起到抗炎的作用[15]。研究指出：促红细胞生成素预处理能够对缺氧复氧损伤之后的心肌细胞和基因表达进行抑制[16]。促红细胞生成素可以对核因子-κB(NF-κB)的活性进行调节进而起到抗炎的作用。促红细胞生成素可以对中性粒细胞的浸润进行抑制从而使得髓过氧化物酶的活性降低，进而降低炎性细胞因子IL-6、ICAM-1和TNF-a的释放，起到抗心肌IRI的作用[17]。

2.5 促红细胞生成素的其它作用

Lipsic等[18]最近进行的研究已得到初步显示,22位初次急性MI的患者一次性给予darbepoetinα (长效的EPO类似物)300μg,72h后与对照组比较,红细胞比容没有明显的差别,而内皮祖细胞(CD34+/CD45-)增多,4月后两组的左室射血分数(LVEF)没有统计学差异,未发现明显的副作用。结果表明,在急性MI时一次性静脉高剂量给予darbepoetinα是安全且可耐受的,并可刺激内皮祖细胞的动员。相关研究指出rhEPO可以减少心肌梗死面积，进而起到保护作用[18]。这和保存ATP与心肌细胞能量代谢以及心肌细胞的调亡抑制有着密切关联。

3 EPO心肌保护作用的给药时机与剂量

促红细胞生成素的摄入时间对心肌保护中的作用有着重要的影响。促红细胞生成素在缺血前后和再灌注时给药都可以对心肌起到一定的保护作用[19]。然而，促红细胞生成素的具体给药时间和心肌保护方面的效果仍然需要深入的研究。目前，促红细胞生成素的使用剂量没有达成一致，实验的剂量通常是以促红细胞生成素在其它的器官保护中采用剂量为参考[20]。Besarab等学者指出在抗IRI上促红细胞生成素的单次给药(1000～5000U/kg)就能够对心肌起到显著的保护作用，同时指出了长期使用促红细胞生成素的副作用，如心绞痛患者的死亡率升高和高血压等[21]。

4 问题与展望

目前认为EPO不仅能促进红细胞的存活、分化与增殖，还能够作为细胞保护的因子对多个器官缺血再灌注和炎症下的损伤起到重要保护作用。促红细胞生成素可以起到激发细胞内的信号转导的途径、增加心肌细胞、内皮细胞的抗凋亡以及抗炎症损伤作用，在减少缺血再灌注坏死心肌的面积和心室功能恢复等方面起到关键保护作用。然而上述研究的对象大部分为动物，促红细胞生成素的用量也大大超出了临床的用量[22-23]。所以对促红细胞生成素的抗IRI作用还有待于进一步地研究，并对促红细胞生成素的作用机制、使用剂量、时机以及安全性和耐受性等进一步的探索。我们相信，随着不断的深入研究，促红细胞生成素能够在心血管疾病临床治疗上起到越来越重要的作用，促红细胞生成素会有着更加广泛的应用前景。

[1] Cai Z，Dominador J，Wei G，et a1．Hearts from rodents exposed to intermittent hypoxia or erythropoietin are protected against ischemiareperfusion injury [J].Circulation，2003，108(1)：79-85．

[2] Jaquet K，Krause K，Tawakol-Khodai M，et a1．Erythropoietin and VEGF exhibit equal angiogenic potential [J].Microvasc Res，2002，64(2):326-333.

[3] Shingo T，Sorokan ST,Shimazaki T,et al．Erythropoietin regulates the in vitro and in vivo production of neuronal progenitors by mammalian forebrain neural stem cells [J]．J Neurosci，2001，21(24)：9733-9743．

[4] Parsa CJ,Kim J,Riel RU,et al.Cardioprotective effects of erythropoietin in the reperfused ischemic heart:a potential role for cardiac fibroblasts [J].J Biol Chem，2004，279(20)：20655-20662.

[5] Li F,Chong ZZ,Maiese K.Erythropoietin on a tightrope:balancing neuronal and vascular protection between intrinsic and extrinsic pathways [J].Neurosignals,2004,13(6):265-289.

[6] Dube S，Fisher JW，Powell JS，et al.Glycosylation at specific sites of erythropoietin is essential for biosynthesis,secretion,and biological function [J].J Biol Chem，1988,263 (33):17516-17521.

[7] Wang FF，Kung CK，Goldwasser E.Some chemical properties of human erythropoietin [J].Endocrinology,1985,116(6):2286-2292.

[8] 李静，王亚平.促红细胞生成素与红细胞生成的调控[J].国外医学临床生物化学与检验学分册,2001,22(5):239-241.

[9] 张映辉，邓继先.红细胞生成素受体研究进展[J].生物技术通讯,1999,10(1):38-45.

[10] Wu H，Lee SH，Gao J，et a1.Inactivation of erythropoietin leads to defects in cardiac morphogenesis [J]．Development，1999，126(16)：3597-3605．

[11] Saraste A,Pulkki K,Kallajok M,et al.Apoptosis in human acute myocardial infarction [J].Circulation,1997,95(2):320-323.

[12] 谢俊然，郁丽娜，段世明.心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的分子调节机制[J].国外医学:麻醉学与复苏分册,2005,26(4):226-228.

[13] 朱妹，王士雯,吴海云，等.红细胞生成素对大鼠心肌缺血-再灌注后抗氧化酶及NO等的影响[J].心血管康复医学杂志,2005,14(5):437-440.

[14] Chong ZZ,KangJQ,Maiese K.Angiogenesis and plasticity:role of erythropoie -tin in vascular systems [J].J Hematother Stem Cell Res，2002,11(6):863-871.

[15] Heeschen C，Aicher A，Lehmann R，et a1．Erythropoietin is a potent physiologic stimulus for endothelial progenitor cell mobilization [J]．Blood，2003，102(4)：1340-1346．

[16] Agnello D，Bigini P，Villa T，et a1．Erythropoietin exerts an antiinflammatory effect on the CNS in a model of experimental autoimmune encephalomyelitis [J]．Brain Res，2002，952(1)：128-134．

[17] Liu X，Xie W，Liu P，et al.Mechanism of the cardioprotection of rhEPO pretreatment on suppressing the inflammatory response in ischemiareperfusion [J].Life Sci，2006,78(19):2255-2264.

[18] Lipsic E,van der Meer P,Henning RH,et al.Timing of Erythropoietin Treatment for Cardioprotection in Ischemia/Reperfusion [J].J Cardiovasc Pharmacol,2004,44(4):473-479.

[19] 秦川，肖颖斌，钟前进，等．EPO预处理对心肌缺氧复氧损伤保护作用的研究[J]．重庆医学，2005，34(5)：734-737.

[20] Gorio A，Gokmen N，Erbayraktar S，et al，Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma [J]．Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(14)：9450-9455.

[21] Besarab A，Bolton WK，Browne JK，et al.The effects of normal as compared with low hematocrit values in patients with cardiac disease who are receiving hemodialysis and epoetin [J].N Engl J Med，1998,339(9):584-590.

[22] van der Meer P，Lipsic E，Henning RH，et al.Erythropoietin improves left ventricular function and coronary flow in an experimental model of isehemia-reperfusion injury [J].Eur J Heart Fail，2004,6(7):853-859.

[23] Parsa CJ，Matsumoto A，Kim J，et al.A novel protective effect of erythropoietin in the infracted heart [J].J Clin Invest,2003,112(7):999-1007.