猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白研究进展＊

刘闰夏，蔺 涛，2，韦祖樟，孙利厂，2，陆嘉琦，袁世山＊

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2.南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的猪的一种高度接触性传染病，该病临床表现形式多样，主要为母猪的繁殖障碍和仔猪的呼吸系统疾病，给养猪业造成严重危害和巨大的经济损失。该病首先在美国、荷兰等地报道，之后在世界范围内迅速流行，并且成为当今养猪业的重大疫病。1996年，郭宝清等首次在我国境内分离到该病原，2006年我国江西、江苏、安徽等多个南方省份暴发了猪“无名高热病”，经研究证实，引起该病的主要病原为发生遗传变异的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒。本文综述了PRRSV结构蛋白的研究进展。

1 PRRSV基因组和表达调控

PRRSV属于套式病毒目（Nidovirales），动脉炎病毒科（Arteriviridae），动脉炎病毒属（Arterivirus），同属的还有马动脉炎病毒（Equine arteritis virus，EAV）、小鼠乳酸脱氢酶升高症病毒（Lactate dehydrogenase－elevating virus，LDV）和猴出血热病毒（Simian hemorrhagic fever virus，SHFV）。根据血清型和遗传特性的差异，可将PRRSV划分为2个基因型，即欧洲（Ⅰ）型（代表株Lelystad virus，LV ）和美洲（Ⅱ）型（代表株 VR－2332），2个基因型在核酸水平上同源性约为60%。

PRRSV为不分节段、聚腺苷酸化、有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组长度约为15kb，5＇非翻译区（untranslated region，5′UTR）长为189～222核苷酸（nucleotide，nt），3＇UTR长约114nt～151 nt。目前已知含有10个首尾重叠的开放阅读框（open reading frame，ORF）。5′端的2个最大的ORF1（ORF1a和 ORF1b）占基因组长度的 3／4。ORF1通过程序性－1核糖体移码（programmed－1 ribosome frame shifting）机制编码产生2个多聚蛋白pp1a和pp1ab，多聚蛋白再经过自身编码的蛋白酶切割产生14个推测的非结构蛋白，分别为Nsp1a，Nsp1β，Nsp2－6，Nsp7a，Nsp7β及 Nsp8－12，这些非结构蛋白在病毒基因组的复制、转录和拮抗干扰素等过程中起到重要的作用［1］。基因组近3′端有8个开放阅读框编码病毒的结构蛋白，结构蛋白的表达需要通过非连续性转录（discontinuous transcription）机制产生亚基因组 mRNA（subgenomic mRNA，sgmRNA）。PRRSV 5′UTR的3′末端最后6个碱基为病毒种特异性保守序列（5′－UUAACC－3′），称 为 前 导 序 列 连 接 位 点 （Leader Junction Site，LJS）。这一保守序列同时存在于基因组下游的每个ORF之前，每个下游的5′－UUAACC－3′被相应地称为编码体序列连接位点（body junction site，BJS）。5′UTR 的 LJS与下游的每个ORF前的BJS相互配对，从而介导5′UTR与下游序列的非连续性跳跃连接，称为“非连续性转录”。除ORF7外，mRNA在结构上呈现为多顺反子（polycistronic），即每一个下游ORF序列都存在于上游ORF的mRNA分子中，但是除mRNA2外它们在功能上却表现出单顺反子的特性，即每条mRNA最5′端的基因翻译产生结构蛋白，mRNA2因同时编码ORF2a和ORF2b，呈现为双顺反子。最新发现的ORF5a大部分序列与ORF5重叠，它们是否由同一个mRNA编码还尚未证实。

2 PRRSV结构蛋白的结构和功能

已知PRRSV有8个结构蛋白。GP2a、GP3、GP4和GP5等囊膜糖蛋白分别由ORF2a、ORF3、ORF4和ORF5编码，非糖基化囊膜E蛋白、ORF5a蛋白、膜基质蛋白M和核衣壳蛋白N分别由ORF2b、ORF5a、ORF6和 ORF7分别编码［2］。根据囊膜蛋白在病毒粒子中组成的量，囊膜蛋白可分为主要囊膜蛋白（major enveloped protein）和次要囊膜蛋白（minor enveloped protein），GP5和 M 蛋白是病毒粒子的主要组成部分，称为主要囊膜蛋白。而GP2a、GP3、GP4和E蛋白在病毒粒子表面的含量相对较少，则称之为次要囊膜蛋白（minor enveloped protein）。

2.1 次要囊膜蛋白

2.1.1 GP2a GP2a由ORF2编码，分子质量为29 ku～30ku，属于Ⅰ型整合膜糖蛋白，N端和C端的疏水结构域分别作为信号肽序列和膜锚定序列。GP2有两个保守的糖基化位点，Ⅰ型PRRSV位于N173和N179位点，而Ⅱ型PRRSV位于N178和N184位点。在Ⅰ型PRRSV反向操作的基础上，将这2个糖基化位点突变，发现突变克隆均能拯救出病毒，说明Ⅰ型PRRSV GP2a的两个糖基化位点（N173和N179）对感染性病毒粒子的形成都是非必需的［3］。有趣的是，Ⅱ型PRRSV GP2a的N184位糖基化位点对感染性病毒粒子的产生是必需的，可能该位点在GP2a蛋白的正确折叠或与其它糖基化蛋白的相互作用中起重要作用。但是，值得指出的是，Tian等将Ⅰ型PRRSV的ORF2－ORF4替换到Ⅱ型PRRSV感染性克隆，能够拯救出嵌合病毒，说明PRRSV的小囊膜蛋白的功能在型间能够互补，提示Ⅱ型PRRSV的糖基化位点对病毒的感染性是非必需的。作者对GenBank上的GP2a通过序列分析发现，在Ⅱ型PRRSV自然毒株中，存在着N184位点糖基化位点缺失的分离株（primepac株），暗示着N184位点糖基化对病毒的感染性是非必需的［4］。

2.1.2 E蛋白 小囊膜蛋白E是由ORF2b编码的一个结构蛋白，由70（Ⅰ型）或73（Ⅱ型）个氨基酸组成，分子质量为10ku。无潜在的糖基化位点，但N端有肉豆蔻基化位点和酪蛋白Ⅱ磷酸化位点，研究表明E蛋白豆蔻酰化对病毒的感染性是非必需的，但是能促进病毒的增殖［5］。E蛋白含有2个半胱氨酸（cys48和cys54），但E蛋白不能形成二硫键连接的同源二聚体。Lee C等［6－7］报道称，E蛋白镶嵌在病毒囊膜中，可能具有离子通道的作用，能促进病毒在感染过程中脱壳完成基因组释放过程。

2.1.3 GP3 GP3为ORF3编码的高度糖基化蛋白，分子质量为45ku～50ku，含265（Ⅰ型）或254（Ⅱ型）个氨基酸。GP3是PRRSV各毒株间保守性最差的蛋白之一，在Ⅰ型与Ⅱ型PRRSV毒株间只有55%的氨基酸同源性，而且多数变异发生在N末端。Ⅱ型PRRSV GP3的C端比Ⅰ型PRRSV的少12个氨基酸，而C端又是一个高变区，含有两型特异的抗原表位，可能参与病毒的中和作用。Ⅱ型PRRSV的GP3最初被认为是一个可溶性的分泌蛋白，不属于结构蛋白的成分。之后的研究证实Ⅱ型PRRSV的GP3与Ⅰ型PRRSV一样作为病毒粒子的小囊膜蛋白［8］。

GP3具有7个潜在的糖基化位点，这些糖基化位点在欧、美两型分离株间非常保守。已经证实，GP3的前6个糖基化位点是确实存在的，最后一个潜在位点是未被糖基化的。并且GP3的N42、N50和N131位糖基化位点对病毒粒子的产生是必需的，而其他3个非必需的糖基化位点影响病毒粒子的生长特性［3］。研究表明，GP3N131糖基化与病毒的免疫逃避有关，缺失N131糖基化位点，突变对高免血清易感，同时也能够激发猪体产生高水平的中和抗体［9］。

2.1.4 GP4 GP4分子质量为31ku～35ku，由183（Ⅰ型）或178（Ⅱ型）个氨基酸组成，为典型的Ⅰ型跨膜蛋白，包含N端和C端强疏水区，含有4个潜在的糖基化位点。GP4任意一个糖基化位点的突变都不影响病毒粒子的拯救，但突变病毒的滴度比亲本毒高，可能是更有利于多聚糖蛋白复合体的形成或突变病毒与细胞受体结合。但任意两个或更多糖基化位点的突变对病毒都是致死性的。GP4的糖基化位点也影响其与CD163的结合从而决定病毒粒子能否进入宿主细胞。GP4单个糖基化位点的突变能够拯救出感染性病毒粒子，因此认为单个糖基化位点突变的GP4蛋白可以与CD163分子有效结合，但是突变2个以上糖基化位点的GP4蛋白不能与CD163分子有效结合，因此其他糖基化位点对GP4与CD163分子的结合起重要作用。此外，GP4蛋白在介导与其他糖基化蛋白的相互作用从而形成病毒复制所必需的多聚蛋白复合体中发挥重要功能［3］。

GP2a、GP3和GP4之间通过非共价结合形成三聚体，同时与E蛋白具有相互作用；且GP5与GP4具有强烈的相互作用，GP5与M蛋白通过二硫键形成异源二聚体，这些蛋白通过相互作用形成多聚蛋白复合体，进而参与病毒粒子的组装。GP4与所有的糖基化蛋白相互作用，在GP4存在的情况下，GP2a、GP3可以通过与GP4的互作间接与GP5结合，因此认为GP4是介导多聚蛋白复合体形成的关键蛋白。此外，GP2a、GP4的糖基化位点不能保护病毒逃避宿主抗体的中和作用［3］。虽然LV株GP4蛋白具有中和表位，但血清的中和抗体效价与GP4抗体的出现似乎没有相关性，其中和作用也远远小于GP5的抗体，因此GP4在诱导中和抗体方面的意义还不明确。

2.1.5 5a蛋白 5a蛋白是最新发现的在动脉炎病毒中普遍存在的第8个结构蛋白，PRRSV的5a蛋白包括46～51个氨基酸，EAV包括43～64个氨基酸。ORF5a的大部分序列与ORF5重叠，它们可能由同一个亚基因组sgmRNA5转录，通过核糖体移码机制表达结构蛋白。Johnson C R等［2］通过质谱分析在高度纯化的Ⅱ型PRRSV病毒粒子中检测到5a蛋白的存在，但该蛋白在细胞和病毒粒子中含量很少。

预测的5a蛋白为Ⅰ型跨膜蛋白，在Ⅱ型PRRSV 5a蛋白的膜内区有2个相邻的半胱氨酸（29和30位），它们可能形成二硫键与5a蛋白单体或其它蛋白形成多聚体。5a蛋白C端有一个在动脉炎病毒中保守的RQ基元，认为能与RNA结合调节mRNA的剪接与转运。Firth A E等［10］通过突变EAV ORF5a起始密码子从而阻止5a蛋白的表达，发现突变病毒比亲本毒的生长滴度降低了2个log，且空斑形态减小，因此认为5a蛋白与动脉炎病毒RNA加工、转运和包装的高效性有关。Han W等［11］将JXA－1传至第80代，在 ORF5a内部 ORF5之前有4个氨基酸的插入，表明5a蛋白胞外区的长度改变不影响5a蛋白的功能。研究证明，在Ⅱ型PRRSV感染的细胞及猪体内，均能检测到5a蛋白及针对5a蛋白的抗体，但是产生的抗体较少，因此5a蛋白可能主要介导的是细胞免疫［12］。

5a蛋白的发现为动脉炎病毒的免疫学及药理学研究提供了潜在的靶点，而对其结构和功能的认识需要更加深入的研究。

2.2 主要囊膜蛋白

2.2.1 GP5 GP5是病毒粒子中最丰富的糖蛋白，含有200（Ⅱ型）或201（Ⅰ型）个氨基酸，分子质量为25ku。经预测，N端是一段31个氨基酸的信号肽，形成三次跨膜结构，膜外区由30个氨基酸组成，C端的50～72个氨基酸为膜内结构域。对不同毒株PRRSV GP5蛋白的氨基酸和核苷酸序列进行比较分析，发现GP5有1个高变区（32aa～40aa）、2个多变区（57aa～70aa和121aa～130aa）、3个保守区（41aa～56aa，71aa～120aa，131aa～200aa）和2～4个糖基化位点。

GP5的糖基化位点及程度在病毒复制过程中的作用尚不清楚。Osorio实验室对经典北美型PRRSV GP5的3个 N－糖基化位点 （N34、N44、N51）进行突变，发现 N33、N55、N33／N55的糖基化降低了病毒的生长滴度，对抗体的敏感性也增强，但该脱糖化病毒却可以激发比野毒株产生更高水平的中和抗体，表明GP5膜外区的多糖的缺失能够提高病毒对抗体的中和能力和其附近中和表位B的免疫原性。同时，该研究中N44糖基化位点的脱糖基化却导致全长cDNA不能拯救出病毒，说明N44位点对该株病毒的复制过程起关键作用。但是，自然毒株中，也存在着较多的N44位糖基化位点缺失的突变毒株，说明了该研究中的N44位点氨基酸的改变（或者可能改变了GP5a的蛋白序列）导致了突变克隆未能拯救出病毒。对欧洲型PRRSV的N46糖基化位点（相对应于Ⅱ型PRRSV N44）进行突变能够拯救出病毒也间接的说明了这一点，但该糖基化位点突变对病毒颗粒的产生和病毒粒子的感染性都有较大影响［3］。其原因可能是失去了寡糖的GP5蛋白不能正确折叠，病毒与受体的相互作用减弱，降低了病毒的特异的感染性。通过对PRRSV自然分离株N44株（GP5N44糖基化位点自然缺失）研究也发现，与VR2332相比，该毒株的N44位点缺失未能提高病毒对抗体的易感性，且GP5中和表位B的免疫原性却显著降低，免疫猪后41d才能产生中和抗体［13］。但该研究没能阐明中和表位免疫原性降低是由于N44位点糖基化位点缺失还是中和表位附近的氨基酸不同（与VR2332相比），且与通过重组腺病毒表达突变N44糖基化位点的GP5免疫鼠的研究结果相矛盾［14］。

GP5蛋白是诱导产生中和抗体的主要结构蛋白，表面存在对于抗感染很重要的中和表位。用猪多克隆抗血清和单克隆抗体鉴定了GP5有1个非中和表位A（27aa～30aa）和1个中和表位B（37aa～45aa）。表位B在PRRSV分离株中高度保守，但不是免疫优势表位，在PRRSV感染后期才出现抗表位B的中和抗体。而表位A具有高变异性，具有免疫优势，在PRRSV感染早期即可出现抗该表位的抗体。因此认为非中和表位A作为一个诱骗表位延迟了中和抗体产生的时间。存在于表位B周围的N－多糖能够降低GP5中和决定簇的免疫原性，可见诱骗表位和具有糖基遮蔽作用的糖基化位点的存在影响了免疫系统对中和表位的识别。

此外，GP5蛋白在体内外均能诱导细胞凋亡，其N端的118个氨基酸对于保持GP5诱导细胞凋亡的活性必不可少［15］。

2.2.2 M蛋白 基质蛋白（M）是由ORF6编码的非糖基化膜蛋白，分子质量约18ku～19ku，北美株和欧洲株分别含有174和173个氨基酸。M蛋白在所有的PRRSV株间都是最为保守的结构蛋白，其N端有3个明显的疏水区（17aa～88aa），形成3次跨膜。M蛋白聚集在其感染细胞的内质网，通过二硫键与GP5形成异源二聚体，参与病毒粒子的形成。

M蛋白具有很强的免疫原性，感染后10d即可以检测该抗体应答，因此检测M蛋白的抗体可以作为PRRSV感染的诊断与监测指征。表达的重组M蛋白可以作为血清学试验的靶抗原，Jiang W等［14］构建的同时表达GP5和M蛋白的腺病毒重组病毒（Ad－GP5－M）在小鼠体内有很好的免疫效果，并且研究表明M蛋白可以通过增强细胞免疫反应和提高中和抗体产生来增强抗GP5的免疫反应。

2.3 PRRSV细胞受体结合蛋白与细胞表面受体

PRRSV具有严格的细胞嗜性（cellular tropism）。在体内，PRRSV仅能感染单核／巨噬细胞谱系细胞；在体外，PRRSV只能感染非洲绿猴肾细胞系MA104及其衍生细胞系 Marc－145；但将PRRSV的基因组RNA转染非容许性 （non－permissive）细胞，如BHK－21和Vero细胞，病毒能够在非容许性细胞系中进行生产性感染（productive infection）；通过 聚 乙 二 醇 （polyethylene glycol，PEG）介 导PRRSV粒子进入非容许性细胞后，病毒可以在细胞内复制并产生感染性病毒粒子。以上研究说明了病毒的囊膜蛋白在介导病毒与细胞受体结合进而入侵细胞的过程起到重要的作用［16］。

迄今为止，PRRSV入侵的细胞受体及与其结合的病毒囊膜蛋白尚存在争议。初步研究发现，存在于猪肺泡巨噬细胞（pig alveolar macrophage，PAM）表面上有3种可能的细胞受体，包括硫酸乙酰肝素（heparan sulphate，Hs）、唾液酸黏附素（sialodhesin，Sn）和CD163。究竟哪种分子是介导病毒吸附（adsorption）的细胞受体（receptor）？这个问题在欧洲和美国学者之间争议颇大。美方证据表明CD163为PRRSV的细胞受体，主要依据是，Marc－145表面不表达Sn，但其却是惟一的体外传代细胞系；PAM和 Marc－145细胞表面均表达受体CD163；CD163能够赋予非容许性细胞复制PRRSV的能力，将表达的CD163的载体转染到非容许性细胞系BHK－21、Vero和PK－15等细胞，病毒通过与CD163的作用来侵入这些细胞进行复制，这个过程不需要Hs和Sn等分子的存在。而欧方则认为Hs、Sn和CD163分子分别在介导病毒结合（binding）、内化（internalization）和 脱 壳 （uncoating）释 放 基 因 组RNA到胞浆中进行复制的过程中起重要作用。在这个过程中，PAM表面的Hs与病毒的M蛋白结合，使病毒粒子在细胞表面聚集，接着Sn通过与病毒的GP5／M复合物相互作用来介导病毒内化（internalization）进入披网格蛋白囊泡（clathrin－coated vesicles），在CD163的作用下，在酸化了的囊泡中释放病毒的RNA，从而完成病毒入侵。换言之，CD163并非病毒受体，而是作为一个辅助病毒颗粒脱壳释放基因组的因子［17－18］。另一方面，在充分有力的试验证据证明CD163是PRRSV受体的前提下，Das等证实了与CD163结合的病毒囊膜蛋白为GP2a和GP4形成的复合体，GP2a和GP4表面的糖原可有效的促进病毒蛋白和受体的结合［19－20］。需要指出的是，由于两个研究小组所认定的细胞受体不一样，所鉴定的相对应的病毒的细胞受体结合蛋白也不一致。换言之，究竟何种结构蛋白或复合体行使PRRSV细胞结合蛋白（viral attachment protein）目前尚无定论。在这些研究之前，Dobbe等在EAV感染性克隆的基础上，将GP5和M蛋白的膜外区替换为PRRSV的相对应蛋白的膜外区，发现GP5和M蛋白的膜外区并不影响病毒的细胞嗜性，暗示着GP5和M蛋白不是细胞受体结合蛋白。

2.4 N蛋白

核衣壳蛋白（N蛋白）是由ORF7编码的一种碱性磷酸蛋白，分子质量为15ku，是病毒粒子中含量最丰富的蛋白，大约占病毒粒子的40%。N蛋白在欧美两型毒株间相对比较保守，分别包括128和123个氨基酸。N蛋白是病毒最主要的抗原组分，具有极强的免疫原性，机体最早产生的是N蛋白的抗体，但为非中和抗体，对机体无保护作用。

成熟的病毒粒子中N蛋白以二聚体的形式存在，研究表明23位的Cys介导形成的N－N同源二聚体对于病毒的感染性是必需的。N蛋白的N端存在一个RNA结合域，此区域富含碱性氨基酸且高度灵活，有助于其和基因组RNA的相互作用，N蛋白最重要的功能即是与基因组RNA结合完成病毒粒子的装配过程。此外，该区域参与蛋白与核酸或其他蛋白的结合，起着分子识别、分子组装和蛋白修饰等功能［21］。

PRRSV复制过程发生于感染细胞的细胞浆，但N蛋白却可以同时定位于细胞浆与细胞核［22］。PRRSV N蛋白含有两段保守的碱性氨基酸，即10～13位和41～47位，分别符合典型核定位信号（nuclear localization signal，NLS）的“pat4”和“pat7”基序，称为NLS－1和NLS－2。N端1～14位氨基酸的删除并不影响N蛋白的核定位，因此NLS－1可能是一个隐含的核定位信号［23］。通过对NLS－2的氨基酸替换，确定了KKNKK是NLS－2的核心序列，且43和44位的赖氨酸足以使N蛋白定位到细胞核中［24］。为了研究N蛋白核定位的生物学功能，Lee C等［22］将NLS序列中43和44位的两个关键的赖氨酸突变成甘氨酸，证明NLS突变不影响子代病毒的产生，但突变病毒滴度降低。用NLS突变病毒接种猪能产生较高的中和抗体，但检测到的NLS序列都发生了回复突变，回复突变使N蛋白重新定位到细胞核，说明N蛋白的NLS位点在体内有很强的选择压力。Pei Y等［25］通过删除或替换构建了9个NLS突变体，大部分突变体影响了N蛋白在细胞核的定位，且突变病毒体外接种猪都产生了高于野生型滴度的中和抗体，表明N蛋白的细胞核定位可能与PRRSV在体内的致病性及宿主应答有关。Tan F等［26］通过构建一系列的缺失及突变感染性克隆，证明Ⅱ型PRRRSV N蛋白N端5～13、39～42、48～52位氨基酸及C端最后4个氨基酸都是非必需的，这些氨基酸的缺失并不影响病毒粒子的感染性。有趣的是，其中5～13、39～42正好分别位于NLS－1和NLS－2功能域。关于N蛋白进入细胞核的功能，目前还没有明确的答案，但在冠状病毒中已经证明N蛋白进入细胞核中可以通过抑制细胞分裂而调控宿主细胞的复制。在PRRSV中，Yoo D等［24］证明N蛋白能够与28S和18S核糖体RNA相互作用，且能够与细胞核中的核仁纤维蛋白相互作用。总之，N蛋白可能通过调控宿主细胞的功能来调节自身的复制，但是具体的作用机制还有待于进一步研究。

3 结语

随着分子生物学和分子免疫学的飞速发展，对PRRSV的基因组结构及其编码的蛋白有了更加全面的认识。反向遗传操作技术（reverse genetic manipulation，RGS）的发展，为研究病毒单个基因在病毒复制过程中的作用提供了平台。RGS技术已用于PRRSV结构与非结构蛋白特性的研究，利用RGS来研究结构蛋白的特性及开发新型疫苗将成为未来的研究方向。

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