肠球菌研究进展*

蒋 伟,黎满香,林荣高,田世成

(湖南农业大学动物医学院,湖南长沙410128)

肠球菌定居于人类和动物的口腔、阴道,是肠道的正常菌群成员之一,且广泛分布于自然界,通常不引起发病,是一种重要的机会致病菌[1]。医学临床上由于抗生素的滥用,多重耐药菌株的出现,使肠球菌的感染率不断上升,成为医院内感染的主要病原菌,通常引起伤口感染、尿道感染、腹腔感染、血流感染等,尤其见于免疫力低下或患有危重基础疾病患者。在兽医临床中,肠球菌引起的畜禽感染也日趋增多[2],给养殖业带来了巨大的损失。

1 肠球菌的分类及生理学特性

1.1 肠球菌的分类

肠球菌属于过氧化氢酶阴性、无芽胞、兼性厌氧的革兰阳性球菌。无法用表型将肠球菌与其他的革兰阳性、过氧化氢酶阴性的球菌相区分,只能通过排除法区分。肠球菌最初被分类为肠内的革兰阳性球菌,之后归入链球菌属。根据其DNA杂交和16 S rRNA序列分析,1984年将肠球菌从链球菌属中分离出来,建立了肠球菌属。1994年《Bergey′s鉴定细菌学手册》(第九版)正式将肠球菌属列为一个独立的菌属。到1999年,肠球菌属正式命名的菌种有19个,分别是鸟肠球菌(E.avium),驴肠球菌(E.asini),病臭肠球菌(E.malodoratus),假鸟肠球菌(E.pseudoavium),棉子糖肠球菌(E.raffinosus),解糖肠球菌(E.saccharolyticus),粪肠球菌(E.faecalis),屎肠球菌(E.faecium),黄色肠球菌(E.flavescens),铅黄肠球菌(E.casseliflavus),鹑鸡肠球菌(E.gallinarum),蒙氏肠球菌(E.mundtii),坚忍肠球菌(E.durans),殊异肠球菌(E.dispar),小肠肠球菌(E.hirae),盲肠肠球菌(E.cecorum),硫磺肠球菌(E.sulfureus),鸽肠球菌(E.columbae)和孤立四联球菌(E.solitarius),至2003年肠球菌属已增加到31个种[3]。

1.2 肠球菌生理学特性

有氧情况下,肠球菌在5℃～50℃范围内皆可生长。粪肠球菌和屎肠球菌能在60℃生存30 min。部分菌株具有溶血性,含50 mL/L的鲜血TSA琼脂板可检测其溶血性,如用兔血或绵羊血,但各种血液对该菌溶血的敏感性差异较大。粪肠球菌和屎肠球菌能在pH 4.6～9.9的范围生长,最适pH为7.5,也能在400 g/L胆汁盐中生长[4]。粪肠球菌能在含65 g/L NaCl的培养基中生长,还具有阳离子平衡功能,能耐酸、碱、高盐及干燥。

2 肠球菌的致病性

2.1 肠球菌对人的致病性

肠球菌感染包括尿道感染、肝胆管的败血症、心内膜炎、外科手术感染、菌血症和新生儿的败血症等。我国医院高致病性区(ICU)感染中肠球菌属在革兰阳性菌中居第3位,位于葡萄球菌、链球菌之后。北京大学深圳医院检验科对2005年10月至2008年8月间从该院临床标本中分离出的184株肠球菌进行鉴定,结果184株肠球菌中粪肠球菌133株(72.3%),屎肠球菌32株(17.4%),其他种类肠球菌19株(10.3%)[5]显示肠球菌感染率明显上升。

2.2 肠球菌对动物的致病性

肠球菌也是动物消化道、生殖道常在菌,在兽医临床中对其导致疾病的研究还不够系统。但不断有其对畜禽危害的报道,如可引起公猪睾丸炎、鹑鸡败血症、鸡胚死亡及产弱雏,引起驼鸟肺部及胸腔化脓、家兔腹泻、羔羊脑炎等[6]。杨跃飞等[7]从鹧鸪眶下窦内分离到1株粪肠球菌,证实肠球菌可引起鹧鸪眼炎。王亚宾等[8]从引起河南省三门峡某猪场肥育仔猪发病死亡的病猪中分离出2株粪肠球菌,证实了粪肠球菌可导致仔猪关节炎及发病死亡。湖南农业大学动物医学院传染病实验室也已用粪肠球菌感染小鼠,期望能从小鼠的病理变化中找出肠球菌导致动物疾病的机制。

3 毒力因子

肠球菌的毒力强弱依次为从临床上分离的、从食物中分离的和从定居地分离的菌株[9]。许多感染被认为是内源性的,细菌通过小肠上皮细胞易位,然后通过淋巴结引起感染,再扩散到身体的其他细胞。因此决定肠球菌毒力的因素很多,如是否能够黏附在细胞外基质蛋白,包括凝血酶敏感素、乳铁蛋白及玻璃体结合蛋白等;是否能够黏附在尿道上皮细胞、口腔上皮细胞和人胚胎肾细胞。而这些因素皆由菌株携带的毒力因子调控。

3.1 聚集物质

聚集物(aggregation substance,AS)是信息素诱导的表面糖蛋白,是细菌质粒得以进行接合传递的蛋白,能黏附真核细胞。另一方面肠球菌表面的聚集物质能形成较大的聚集物,因此给细菌提供了病原性。聚集物的存在增加了细菌表面的疏水性,诱导胆固醇定位在吞噬小体内,延迟或阻挡了溶酶体的融合作用。Tendolkar P M等[10]在研究肠球菌引起的心脏感染的小鼠模型时,发现给小鼠注射含有聚集物质AS及结合物质EBS(enterococcal binding substance,AS受体)的菌株AS+EBS+株,小鼠出现症状并死亡,给予AS—EBS—株则均存活,进一步在用导管插入术构造心内膜炎的小鼠模型中发现,AS+EBS+菌株产生的赘生物较大,脾肿大更严重,认为AS在心内膜炎中起重要作用。

3.2 胶原结合蛋白

胶原结合蛋白(accessory colonization factor,Ace)是另一种粪肠球菌的表面蛋白,它属于微生物表面成分识别黏附基质分子家族,介导肠球菌黏附于宿主细胞外基质蛋白,引起感染发生,是肠球菌的主要毒力因子之一[11]。胶原结合蛋白在心内膜炎中起着重要作用。

3.3 表面蛋白

表面蛋白(enterococcus surface protein,esp)基因在感染来源的分离株中出现频率高,它编码的蛋白可以促进细菌吸附、定殖在宿主细菌上和逃逸宿主免疫系统的清除作用。esp参与肠球菌生物膜的形成,而肠球菌的生物膜能帮助细菌抵抗不良的环境,帮助吸附在真核细胞如尿道上皮细胞上,因此在抵抗抗生素中起重要作用。研究表明,esp基因的破裂损害了粪肠球菌形成生物膜的能力,esp—粪肠球菌株在获得含esp基因的质粒后,又能产生细胞膜[12]。湖南农业大学动物医学院传染病实验室从死亡猪体内分离的42株菌中esp基因的检出率为38%,在正常猪体内分离菌株未检出该基因,提示该基因可能与致病性有密切关系,这与Mannu L[28]结果一致。esp+屎肠球菌比esp—屎肠球菌具有更高的结合率,而且对氨比西林、环丙沙星和亚胺培南具有更高的抵抗性[13]。

3.4 溶血素

肠球菌溶血素(cytolysin,cyl)是一种细菌毒素,其基因位于信息素应答的质粒里。溶血素对人血有β-溶血的作用,对其他革兰阳性细菌有抑制作用。溶血素基因以高发生率出现在临床分离株(33%,与食物分离株6%对比)[14]。

3.5 透明质酸酶

透明质酸酶(hyaluronidase,hyl)能分解机体组织的透明质酸,是一种降解与组织破坏有关的酶。透明质酸酶能解聚结缔组织的粘多糖,促进细菌和毒素在组织内扩散[15]。透明质酸酶由细菌基因组上的hyl基因编码的。

3.6 明胶酶和丝氨酸蛋白酶

明胶酶(gelatinase,gelE)是一种由粪肠球菌分泌的细胞外锌离子金属蛋白内肽酶。能水解明胶、酪蛋白、血红蛋白和生物活性肽,引起细菌扩散,参与炎症的进程。吴利先等[16]构建粪肠球菌丝氨酸蛋白酶(serine protease,sprE)基因的突变株,突变株在40℃的生长能力以及在氧化条件下的存活率均明显降低,说明sprE基因在细菌抵抗外界温度环境中具有一定的作用。

3.7 心内膜炎抗原

心内膜炎抗原(endocarditis antigen,efaA)是肠球菌的表面蛋白黏附素,可以分泌到血清中与细胞壁结合,粪肠球菌通过EfaA的黏附作用,通过EfaA定植于心内膜、形成生物膜、导致感染性心内膜炎[17]。efaA是肠球菌的重要毒力因子之一。

3.8 信息素

信息素(pheromone)是粪肠球菌分泌的一个小的线形肽段(7～8个氨基酸),可诱导肠球菌的asa1等基因,表达聚集物质,促进菌株之间质粒的接合转移,及黏附宿主细胞。同时信息素还具有人白细胞趋化剂的作用,诱导其分泌溶酶体酶,激活补体系统,引起炎症部位的组织损伤[18]。

3.9 荚膜多糖

荚膜多糖(capsular polysaccharides,cps)在许多微生物中是主要的毒力因子,主要帮助微生物逃避免疫系统的监测和清除。Hancock L E等[19]构建了无荚膜多糖的粪肠球菌的突变体,结果表明,突变体在体外增强了对巨噬细胞杀灭的敏感性,在体内聚集在淋巴结的周围,表现为抵抗力下降。

4 肠球菌的耐药性

自1986年首次从环境中分离到耐万古霉素粪肠球菌V583以来,对于肠球菌耐药性的监测及其耐药机制的研究受到广泛关注。目前对肠球菌耐药性监测显示,其耐药性日益增强,而且在近几年来不断的报道有对新的药物耐药,甚至是还未投入使用的药物产生耐药性。所以对于肠球菌耐药机制及其防治对策的研究已愈显重要。近年来的研究结果显示,肠球菌耐药机制可以分为两类,一类是由于肠球菌的细胞壁较厚,导致其固有的由染色体介导的耐药性。另外一种是由于肠球菌通过转座子、整合子-基因盒系统等途径获得外源DNA片段,从而获得多种耐药性。

4.1 肠球菌固有耐药性

肠球菌的固有耐药性主要是针对β-内酰胺类抗生素的耐药性。据报道,肠球菌对于青霉素的敏感性较低,尤其是粪肠球菌对其敏感性比一般细菌低10倍～100倍,而屎肠球菌对比粪肠球菌又低约15倍。导致这种差异主要是由于肠球菌能合成一种低青霉素结合蛋白(PBPs),使细菌与青霉素的结合率降低,从而达到使之耐药的目的。研究显示,肠球菌对该类药物的耐药性与β-内酰胺酶的合成量成正比,并有细菌滴度依赖性,即细菌浓度在107cfu/mL以上,才显示对β-内酰胺类抗生素耐药,这一结论也在湖南农业大学动物医学院传染病实验室近期研究中得到证实,这可能亦是临床上很少分离到对青霉素及氨苄西林高度耐药菌株的原因。另外肠球菌还可以产生过量慢反应青霉素结合蛋白(PRS),使青霉素与氨基糖苷类药物联合用药也不能起到治疗作用。

4.2 肠球菌获得性耐药性

肠球菌属细菌除了本身具有的耐药性而外,还可以从环境中获得耐药性。一是通过接合型转座子获得外源基因,从而获得耐药性。接合型转座子综合了质粒、噬菌体、转座子等可移动性元件的特性,能使耐药基因乃至毒力基因在细菌及环境中广泛传播。自1986年首个转座子Tn916型被发现以来,Tn1514、Tn1546、T n916、Tn1545相继被证实与肠球菌耐药性有关;二是通过整合子-基因盒系统[20]来获得耐药性。整合子-基因盒系统是在肠球菌中存在的一类天然的基因克隆系统,其具有自己的翻译起始位点,具有比较突出的基因捕获能力和表达能力,能从环境中捕获多种耐药性基因并整合到整合子上并通过自身的表达系统进行表达,而且其基因盒中可以同时整合多个基因,使单个菌株具有多重耐药性。另外肠球菌还可以通过自我修饰从而达到耐药的目的。以耐万古霉素粪肠球菌为例,即是通过调节其基因的表达,使其与糖肽类抗生素的结合位点末端的D-丙氨酸-D-丙氨酸残基改变为D-丙氨酸-D-乳酸,使药物不能与其靶标结合,从而达到耐药的目的。

近年来,研究人员试图从肠球菌属的进化过程中的一些遗传标记来寻找其耐药机制,已取得明显的成效,如Kelli L等[21]利用成群的、周期性的空间短回文序列重复(clustered,regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)将历史分离菌株利用多重序列位点分分型(multiple locus secequence typing,MLST)进行基因分型,然后检测其基因组中CRISPR,分析得出CRISPR-Cas的存在与菌株耐药性存在显著性关系。

5 肠球菌的实验室检测技术

5.1 细菌学检测方法

肠球菌在临床诊断中很容易和链球菌相混淆,因为肠球菌和链球菌属于同一个科中的不同属,所以实验室常采用链球菌选择培养基进行肠球菌的初选,临床上经常用链球菌增菌培养基来初选肠球菌。然后是将吡咯烷酮芳胺酶(PYR)试验与氯化钠-胆汁七叶苷试验结合应用,即将待检菌新鲜培养物大量接种置35℃培养4 h观察结果,以培养基变褐色或黑色为阳性[22]。但是肠球菌的生化试验结果差异较大,仅以形态、培养和生化反应等表型特征难以将细菌准确归类。张联璧[23]报道在肠球菌鉴定中,首先表现为革兰阳性球菌、触酶阴性、成对或成链排列的菌株可先用万古霉素、PYR等试验区别不同的菌属,符合肠球菌属者,再按不同试验对不同群的不同种进行鉴定。对于种间的鉴定,可参照Carvalho Mds G等[24]提出的鉴定方案进行。

微生物鉴定的自动化技术在近十几年里得到了飞速的发展,使得肠球菌的鉴定也变得更加的迅速和准确。薛青红等[25]利用BIOLOG自动微生物分析系统和传统鉴定方法同时对1株猪源粪肠球菌进行了鉴定,结果显示,2种鉴定方法的结果一致,与传统的鉴定方法对比。

5.2 分子生物学检测

由于常规的病原学诊断方法包括样本中的细菌分离培养及药敏试验,所需时间较长,已经难以及时指导感染性疾病的治疗。但随着细菌分子生物学与基因组学的飞速发展,快速、灵敏的核酸检测方法己用于细菌的检测,并且广泛被人们所接受。目前分子生物学检测技术在肠球菌种、属水平都有较多的报道。

Wellinghausen N等[26]应用荧光原位杂交的方法快速诊断与临床密切相关的肠球菌,如粪肠球菌、屎肠球菌和鹑鸡肠球菌,结果表明该方法具有很强的敏感性和特异性。为了从属的水平对肠球菌做出鉴定,Liu D等[27]用粪肠球菌种的特异假定的转录调控基因作为靶序列,设计PCR引物扩增518 bp的DNA片段,这个片段只出现在粪肠球菌中,而不出现在其他的肠球菌中,可用来作为粪肠球菌的特异性诊断方法。Halliday E等[28]以肠球菌特异的23 S rDNA序列为靶序列,用定量PCR检测肠球菌在海滩上的分布。Jackson C R等[29]设计属和23个种的肠球菌特异性引物,使用7组多重PCR能够同时将肠球菌属及种鉴定出来,这些属和种的多重PCR使得肠球菌的诊断更为快速。

在肠球菌种的分子生物学鉴定方面还有许多其他有效的方法。建立多种快速、结果易于判读的鉴定细菌的分子生物学诊断方法是对常规检查方法的一种有益的补充。相信随着现代化生物学技术的不断发展,将会出现更多更好鉴定细菌的方法,使肠球菌的鉴定更加完善。

5.3 血清学鉴定方法

肠球菌亚群属于革兰分群的D群,所以血清学的检测方法有链球菌乳胶凝集分型法。除此之外,用得最多的就是ELISA方法,如Hufnagel M等[30]用荚膜多糖特异性ELISA分析了4个国家不同地方临床感染病例中分离的157株粪肠球菌的血清型,分析结果表明,优势血清型的地理区域特征不明显。周霞等[31]利用粪肠球菌的超声波裂解物包被ELISA反应板,通过棋盘滴定方法筛选最佳反应条件,成功地建立了检测致羔羊脑炎粪肠球菌抗体的间接ELISA方法,利用该方法检测了来自未免疫绵羊场的50份成年绵羊的血清和50份羔羊的血清,结果表明,2份成年绵羊的血清为阳性,其他样品均为阴性。

6 展望

人们一直认为肠球菌是人类正常的微生物菌群、是无害的、在医学上也是不重要的。直到肠球菌成为医院里最普通的病原,引起较高的死亡率,肠球菌在不利环境下的生存能力较强,能多途径引起交叉污染,包括通过食物、环境及医院途径引起人类的疾病,才开始对肠球菌重新认识。由于多重耐药性肠球菌的暴发,近年来对于肠球菌的关注已日益增加,而且近年来的相关研究已经取得了相当的进展,但对于逐年上升的感染率和日益增多的耐药株的出现,对肠球菌在致病过程中的作用机制研究及寻求新的治疗方法已迫在眉睫。而对于目前肠球菌的分类鉴定,特别是与D群的链球菌相区分,需要进一步的研究来提高效率和准确性。总之,进一步地探明肠球菌的生物学特性、致病机制、耐药性、实验室诊断以及治疗方法等是控制肠球菌感染的重要的理论基础。

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