细胞周期蛋白激酶抑制因子p27 Kip1研究进展

陶金程,汉丽梅,刘 佳,于天明

(沈阳农业大学,辽宁沈阳110866)

肿瘤是机体在各种致癌因素作用下,局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控,导致其克隆性异常增生而形成的新生物,肿瘤的发生是多阶段、多步骤的复杂过程。近年来,人们注意到几乎所有的癌基因、抑癌基因都直接或间接地参与了细胞周期的调控,有的其本身就是细胞周期调控的主要成分,它们的异常表达可导致细胞周期调节失控,p27蛋白是新近发现的CDKI家族成员之一,是一类重要的细胞周期调控蛋白,目前已成为肿瘤研究的一个热点。端粒酶是一种核糖蛋白酶,具有逆转录酶活性,能以端粒酶RNA(hTR)为模板,向染色体末端添加T2AG3序列,端粒酶对肿瘤细胞获得无限增殖特性进而成为永生化细胞起了重要作用。文章针对p27,p27与肿瘤、端粒酶的关系进行了综述。

1 p27 Kip1概述

1.1 p27 Kip1基因

Polyak K等在转化生长因子-β(transforming grow th factor-β,TGF-β)和经细胞接触处理的生长抑制细胞中发现了一种相对分子质量为27 000的热稳定蛋白。这种物质在体外与细胞周期蛋白ECDK2和细胞周期蛋白D-CDK4紧密结合,并以一种化学剂量的关系抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinases,CDKs)的活性,因此被称为p27 Kip1(p27或kip1)。p27基因定位于人体12号染色体的12p12.0～12p13.1交界处。含有两个参与编码的外显子,能编码一个198氨基酸的多肽。真核生物细胞周期失控是细胞增殖过度及癌变的重要原因,在细胞周期中有3个调控点,这3个调控点分别是G0-G1、G1-S、G2-M,其中G1-S期和G2-M期最为重要,细胞一旦通过G1-S1期,它就进入DNA合成期,如果DNA受到损伤且未得到正确修复,细胞就不能通过G2-M期。参与细胞周期调控的主要分子有,细胞周期蛋白(cyclin)、CDKs和CDK抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitors,CDKI)。其中CDKI按照结构和功能的不同分成两大类,一类是Ink4(inhibitor of cdk4),包括p15、p16、p18、pl9;另一类是Cip/Kip(CDK-interacting protein/kinase inhibition protein),包括p21Cip-1、p27Kip-1和p53 Kip-2。CDKI是近几年来分离得到的一类重要的细胞周期调控蛋白,参与细胞G1期进入S期的负调控,可防止细胞过度增殖和恶变。p27基因属于CDKI家族成员之一[1],通过多种方式参与细胞周期调控,最终抑制细胞的分裂和增殖,促进细胞的分化和凋亡。

1.2 p27 Kip1蛋白

Toyoshima H等用酵母双杂交系统,在研究与cyclinD-CDK4相互作用的蛋白时,克隆了鼠的p27cDNA,其片段长茺为591 bp,蛋白由197个氨基酸组成。人的p27cDNA长为594 bp,其蛋白由198个氨基酸组成。研究发现,p27是高度保守的蛋白分子,在鼠、貂中p27蛋白的氨基酸顺序非常相似,有90%的同源性。p27蛋白的有序结构刚性卷曲、β-发夹和β-铰链等疏水性残基在形成cyclin-CDK2-p27三元复合物时的分子间接触中起重要作用。β-铰链在主链间形成的6个氢键及310-螺旋插入到CDK2的催化集团能稳定三元复合物的结构。Mont法模显示p27蛋白β-发夹和β-铰链二级机关形成的天然分子间界面是形成三元复合物快速动力学转变的关键[2]。Verkhivker C M等[3]曾通过改变退火温度研究了分子间作用对p27三元复合物结构预测的影响。p27蛋白通过化学计量方式与CDK或cyclin/CDK复合物结合,抑制cyclin/CDK复合物的活性,阻止细胞周期中G1到S期的转换,使细胞周期停滞于G1期,抑制细胞增殖,促进介导细胞间黏附及诱导凋亡[4]。p27蛋白通过N-末端与cyclin/CDK复合物结合,阻断了cyclin/CDK复合物和ATP结合,导致CDK裂解,最终抑制了cyclin/CDK的活性[5]。通过转录、翻译及翻译后调节p27蛋白表达水平是调控p27抑制功能发挥的主要机制[6]。p27活性调节一个主要机制是磷酸化,其具有多个酪氨酸、丝氨酸、或苏氨酸的磷酸化位点。p27对cyclin/CDK复合物活性的抑制作用比较弱,其实现是通过相关蛋白磷酸化[8-9]。

2 p27 Kip1与肿瘤

p27可以以多种方式参与细胞周期调控,最终抑制细胞分裂和增殖,促进细胞分化和凋亡,因此,它与肿瘤的发生、发展、诊断及治疗均存在密切的关系。

2.1 p27 Kip1基因在肿瘤中的研究

p27蛋白是一种非常规的抑癌因子,因为它的基因突变在肿瘤中非常罕见,这意味着在肿瘤的发展中蛋白质的正常功能被破坏[10]。同时细胞周期各时相中p27mRNA水平无明显改变,而p27蛋白的表达却体现出时相特异性,其表达水平在GO期细胞中最高,S期其表达水平下降,当细胞内DNA合成达到高峰时,降至最低,提示p27蛋白表达的改变可能是翻译或翻译后水平的调节的结果。p27基因与肿瘤的关系则主要体现于p27蛋白水平而非基因水平的改变[11]。Kawamata N等运用Southern杂交和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测432例多种(包括胃癌、卵巢癌、肺癌、子宫内膜癌等)恶性肿瘤和20株癌细胞株中的p27基因突变,仅发现l例第109位密码子的多态性和l例静止突变,其余均无基因突变、缺失和重排等异常。

2.2 p27 Kip1蛋白在肿瘤的表达及临床意义

在细胞周期调控机制中,p27是最关键的抑制因子之一,几乎可以抑制所有的CDK和cyclin复合物激酶活性[12],它是一个不仅能调控细胞周期还能抑制细胞分裂的重要因子[13],在细胞增殖、细胞分化以及细胞凋亡等过程中都起着非常重要的作用。越来越多的证据表明p27蛋白可能成为多种人类肿瘤的独立预后因子和未来肿瘤治疗的新靶点[14]。研究表明,p27基因在静止细胞内含量较高,而在增殖细胞内其含量非常低,因此认为p27蛋白表达水平及活性改变与肿瘤的形成及预后有关,p27的错误调节导致其失活及降解增加,与癌症的发展相关[15-16]。目前研究发现,多数妇科肿瘤都存在p27蛋白表达异常,且影响某些疾病的预后[17]。吴芃等[18]研究发现p27蛋白主要在细胞核中表达,肾癌组表达率明显低于正常组(P＜0.05),且在肿瘤不同的临床分期及病理分级间的表达有显著差异(P＜0.05);p27mRNA的表达在正常组织和肾癌组织中无明显差异,表明p27的表达调控可能是基于翻译阶段的蛋白降解,p27低表达可能促进肿瘤的演进与发展。邓荣辉等[19]用免疫组化的方法研究乳腺癌中p27表达表明,60例正常乳腺组织与乳腺癌组织中p27高表达率相比,两者差异有统计学意义。乳腺癌组织中p27高表达与腋窝淋巴结转移、复发和转移有关,与正常乳腺组织相比,p27的表达降低与乳腺癌的发生有明显关系。魏茂富等[20]采用免疫组化方法,分别检测20例正常大肠黏膜、22例大肠腺瘤和69例大肠癌中p27蛋白表达情况,高、中和低分化大肠腺癌组织中阳性表达率分别是100.00%、88.24%和31.91%,统计学分析表明高分化腺癌与中分化腺癌相比差异没有统计学意义(P=1.000),而两者与低分化腺癌相比差异有统计学意义(P＜0.05),表明P27的表达与肿瘤分化程度呈负相关,而与临床其他病理因素均无相关性(P＞0.05),故p27蛋白检测可作为评价大肠癌恶性程度的重要指标。膀胱移行细胞癌(bladder transitional cell carcinoma,BTCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,具有生长缓慢、多中心性、易复发等临床特点,李朝争等[21]证实p27在膀胱移行细胞癌组织中表达阳性率明显低于正常黏膜组织,p27在BTCC中表达水平与肿瘤病理分级、临床分期和淋巴结转移等均显著相关。p27阳性表达随恶性程度增加而降低,提示p27与BTCC发生发展有关,可能抑制肿瘤的恶性表型,抑制肿瘤的浸润和转移。还如外源性p27基因可作为目的基因用于肿瘤的基因治疗,在这方面也有相关报道,如将外源性p27基因导入星形胶质瘤细胞,可使外源性p27基因在这些肿瘤细胞内高表达,明显抑制肿瘤的生长。

3 p27 Kip1与端粒酶

端粒酶活性与细胞周期调控之间的关系尚不十分清楚,但有研究表明端粒酶活性与细胞周期调控密切相关。通过研究证实在细胞周期的不同时期端粒酶的活性不同,阻滞于G1/S期的肿瘤细胞中端粒酶活性与非同步培养物中活性水平相仿[16];通过S期时端粒酶活性增高,S期细胞可检出最高水平的端粒酶活性;而在G2/M期几乎检测不到端粒酶活性,这些试验结果建立了端粒酶和细胞周期运行间的细胞周期依赖性调节的关系。p27作为一种非特异性的多功能CDKI,通过多种方式对细胞周期进行负性调控,从而使细胞停滞于G1期,抑制了细胞的生长增殖,其主要功能是抑制G1期复合物cyclin-CDK的活性,阻止细胞周期G1/S转化,从而抑制细胞增殖[22]。Kondo S等认为p27蛋白的表达与端粒酶活性可能有联系。细胞周期依赖性激酶抑制剂p27是细胞周期G1期限制性位点的调控因子[23],而端粒酶活性的表达是恶性肿瘤细胞无限增殖的分子基础,抑制细胞端粒酶活性,将导致细胞端粒变短并激活细胞衰老途径[24]。p27蛋白作为CDK抑制剂(CKI)CIP/KIPI家族成员之一能与各种CDK复合物、周期蛋白A、E、D1、D2和D3都能相互作用,并引起细胞生长停止于Gl期;而端粒酶在细胞周期G1期活性明显升高、S期达到高峰。端粒酶与p27蛋白间确切的相互作用机制还有待进一步研究。

4 展望

p27基因作为一种新的肿瘤候选抑制基因正越来越引起人们的研究兴趣,但对于p27作用的机制目前还知之甚少,甚至可能还有很多功能没有被发现。对p27进行修饰后能否起到更有效的肿瘤治疗效果,其对于某些肿瘤的预后和指导治疗作用能否真正用于临床。此外端粒酶活性与p27在细胞周期调控之间的关系,两者在细胞衰老中到底有何作用,以及在肿瘤发生、发展和治疗方面的作用,有待进一步研究。相信随着分子生物学的发展,这些问题都将获得圆满解决。

[1] Chan H L,Hui A Y,Wong M L,et al.Genotype C hepatitis B virus infection is associated with an increased risk of hepatocelhlar carcinoma[J].Gut,2004,53(10):1494-1498.

[2] Verkhivker C M.Protein conformational transitions coupled to binding in molecular recognition of unstructured proteins:hierarchy of structural loss from all-atom Monte Carlo simulations of p27Kip1 unfolding-unbinding and structural determinants of the binding mechanism[J].Biopolymers,2004,75(5):420-433.

[3] Zhang W,T ong Q,Wu Q,e t al.Upregulated p27kip1 can downregulate survivin expression and inhibit telomerase activity in gastric carcinoma cel[J].Cancer Invest,2009,27(9):898-900.

[4] Hong YB,Kang HJ,et al.Inhibition of cell proliferation by a resveratrol analog in human pancreatic and breast cancer cells[J].Exp Mol Med,2009,41:151-160.

[5] Verkhivker C M.Protein conformational transitions coupled to binding in molecular recognition of unstructured proteins:deciphering the effect of intermolecular interactions on computational structure prediction of the p27Kip1 protein bound to the cyclin A-cyclin-dependent kinase 2 complex[J].Proteins,2005,58(3):706-716.

[6] Bagui T K,Cui D,Roy S,et al.Inhibition of p27KIP1 gene transcription by mitogens[J].Cell Cycle,2009,8:115-124.

[7] Trabosh V A,Divito K A,D Aguda B,et al.Sequestration of E12/E47 and suppression of p27KIP1 play a role in Id2-induced proliferation and tumorigenesis[J].Caroinogenesis,2009,30:1252-1259.

[8] Morishita D,Katayama R,Sekimizu K,et al.Pimkinases promote cell cycle progression by phosphory lating and down-regulating p27Kip1 at the transcriptional and posttranscriptional levels[J].Cancer Res,2008,68:5076-5085.

[9] Tossidou I,Dangers M,Koch A,et al.Tyrosine phosphatase SHP-2 is a regulator of p27(KIP1)tyrosine phospho rylation[J].Cell Cycle,2008,7:3858-3868.

[10] Lee J H,Kim S S.The function of p27KIP1 during tumor development[J].Exp Mol Med,2009,41(11):765-771.

[11] Cariou S,Donovan J C,Flanagan W M,et al.Down-regulmion of p21WAFI/CIPI or p27Kip1 abrogates antiestrogen-mediated cell cycle arrest in human breast cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(16):9042-9046.

[12] Conradie R,Bruggeman F J,CilibertoA,et al.Restriction point control of the mammalian cell cycle via the cyclinE/Cdk2:p27 complex[J].FEBS J,2010,277(2):357-367.

[13] Vervoorts J,Lüscher B.Posttranslational regulation of the tumor suppressor p27(KIP1)[J].Cell Mol Life Sci,2008,65(20):3255-3264.

[14] Chu I M,Hengst L,Slingerland J M.The CDK inhibitor p27 in human cancer:prognostic potential and relevance to anticancer therapy[J].Nat Rev Cancer,2008,8:253-267

[15] Dan D,Hershko M D.Oncogenic properties and prognostic implications of the ubiquitin ligase Skp2 in cancer[J].Cancer,2008,112:1415-1424.

[16] Mishra A,Godavarthi S K,Jana N R.UBE3A/E6-AP regulates cell proliferation by promoting proteasomal degradation of p27[J].Neurobiol Dis,2009,36(1):26-34.

[17] Sui L,Dong Y,Watanabe Y,et al.Clinical significance of Skp2 expression,alone and combined with Jabl and p27 in epithelial ovarian tumors[J].Oncol Rep,2006,15(4):765-771.

[18] 吴 芃,郑少斌.p27kip1在肾癌中的表达及临床意义[J].南方医科大学学报,2010,30(8):1883-1886.

[19] 邓荣辉,周慧霞.乳腺癌中p27表达及其临床意义[J].实用癌症杂志,2009,24(2):203.

[20] 魏茂富,卢义生.p27在大肠癌、大肠腺瘤及正常大肠粘膜中的表达及临床意义[J].中国现代医生,2009,47(7):113-114.

[21] 李朝争,张祥宏.膀胱癌中Skp2与p27表达的临床意[J].中华腔镜泌尿外科杂志,2009,3(3):253-255.

[22] Polyak K,Kato J Y,Sherr C J,et al.p27Kip1,acyclincdk inhibitorlink stransforming growth faetorbeta and contact inhibitor of cell cycle alx est[J].Am J Pathol,2001,115(1):32-38.

[23] Li X,Hui A M,Shi Y Z,et al.Deregulation of G1/S transition is a common event in carcinoma of the ampulla of vater[J].Hepatogastroenterology,2002,49(47):1239.

[24] Rowley P T,Tabler M.T domexme inhibitors[J].Anticancer Res,2000,20(6):4419.