β-防御素在天然免疫中的作用*

孙 岩,王 路,温俊歌,薄联锋,徐志坤,张德礼*

(1.西北农林科技大学动物医学院,陕西杨陵712100;2.河北农业大学动物科技学院,河北保定071000)

防御素(defensins)广泛存在于生物界,具有广谱抗微生物活性,属于生物体天然免疫系统,是古老防御机制的一部分。β-防御素是Diamond等1991首先在牛的气管黏膜上皮细胞中发现的,后又在牛粒性白细胞中发现了13种与其高度相似的序列,但共有序列与α-防御素不同,故被命名为β-防御素,主要分布于牛的骨髓以及人和多种动物(牛、羊、猪、骆驼、驯鹿、小鼠、大鼠)的胃肠道、呼吸道、舌、牙龈、肾、皮肤的上皮中。

1 防御素的种类与β-防御素的结构

防御素是一类富含半胱氨酸和精氨酸的内源性阳离子低分子抗微生物短肽。根据防御素分子内半胱氨酸和精氨酸的位置、连接方式、前体性质及表达位置的差异可分为5种类型,即α-防御素,β-防御素,θ-防御素,昆虫防御素,植物防御素。

成熟的β-防御素由38～42个氨基酸残基组成,它的分子结构中含有6个保守的半胱氨酸残基,分子中二硫键连接方式为Cys1-Cys5、Cys2-Cys4、Cys3-Cys6。β-防御素由2个外显子和1个内含子组成,外显子1编码防御素前体分子的信号肽序列和部分前片段序列,外显子2编码部分前片段序列和成熟肽序列。

2 天然免疫系统

天然免疫系统是宿主抵抗多种病原微生物的第一道防线,在感染后迅速被激活,抑制病原的复制。天然免疫机制包括物理防线、体液免疫和细胞免疫等方面。物理防线是最外层的屏障,包括皮肤、内皮层以及他们分泌的因子。一旦病原突破第一道防线,天然免疫细胞就会被激活继而分泌细胞因子和趋化因子来抑制病原体的复制。先天免疫细胞激活的基础即模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)在很多免疫细胞中表达,如巨噬细胞、树突状细胞和B细胞。由于这些受体的存在,天然免疫细胞可以识别许多微生物共有的保守结构。目前研究最多的模式识别受体是Toll样受体(toll-like receptor,TLR)。

3 β-防御素的抗病原体活性

作为天然免疫的一部分,β-防御素可以保护宿主免受多种病原体的入侵,如细菌、真菌、病毒、寄生虫等。

在抗菌方面,β-防御素有广谱、高效的抗菌活性。一方面β-防御素能穿透菌体细胞壁和细胞膜,杀死一些耐抗生素的细菌[1],另一方面即使是合成的类似人β-防御素(humen beta defensin,hBD1-3)碳末端结构域的多肽同样具有抗菌活性[2],经其处理过的大肠埃希菌有明显的形态学变化。然而β-防御素也有偏好性,如hBD2优先杀死革兰阴性菌绿脓杆菌,而非革兰阳性菌葡萄球菌。同时不同种类的β-防御素抑菌机制也不同,hBDs可以黏附于结核分支杆菌的细胞膜,而hBD3还可以抑制葡萄球菌细胞壁的生成[3]。此外Scudiero O等[4]通过比较7种人工合成的hBD类似物确定了β-防御素发挥抗菌活性的核心结构域,如hBD1、hBD3的核心结构域分别位于肽链中部和羧基端。

在抗真菌方面,研究表明防御素尤其是β-防御素在体外可以杀死或抑制真菌的繁殖,如hBD1[5]可以抑制多种念珠菌如白念珠菌、克柔假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌,而hBD2和hBD3虽有类似的抑制真菌的效果,但对光滑假丝酵母菌不起作用。此外,防御素还可以阻止光滑假丝酵母黏附到上皮细胞从而抑制其感染。

在抗病毒方面,β-防御素可以抑制多种被膜病毒的感染。hBD2、hBD3抑制人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的复制;在传染性软疣病毒感染患处,hBD3的表达量大幅上升[6];猪源β-防御素(porcine beta defensin,pBD3)能显著抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染猴肾细胞Marc-145[7];hBD2在抗呼吸道合胞病毒(RSV)中发挥重要作用,主要机制为RSV激活NF-κ B信号通路,介导产生促炎症细胞因子-肿瘤坏死因子(TNF),从而调节hBD2的表达[8]。试验表明体外重组鼠β-防御素(murine beta defensin,mBD)可以阻止流感病毒入侵,从而抵抗病毒感染[9]。

在抗寄生虫方面,hBD1和hBD2可以在肠道内有效抑制多种隐孢子虫孢子发芽,从而抑制体内隐孢子虫孢子的感染。

β-防御素的抗菌活性依赖于离子种类和浓度,如Vylkova S等[10]发现hBD2杀死白念珠菌依赖于盐离子浓度。β-防御素对盐离子敏感的程度不同,在hBD1-4中hBD3是最不敏感的。

4 β-防御素与炎症反应

炎症反应可以使组织消除有害刺激,启动组织愈合。但是不恰当的炎症反应会导致组织损坏甚至疾病,所以当机体不再需要炎症反应时应当立即终止。就这一点而言,β-防御素在调节炎症反应中发挥重要作用。终止的机制首先是β-防御素刺激产生内源分子如抗炎症细胞因子、脂质介质、糖皮质激素,其次是诱导免疫细胞凋亡。

β-防御素可以诱导产生炎症因子和趋化因子。研究表明hBD2-4能够刺激角质细胞释放细胞因子和趋化因子如IL-6、IL-10、IFN-γ诱导蛋白(IFN-γinducible protein,IP-10)、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein,MCP-1)等来激活T细胞表达和细胞因子分泌[11]。

还有研究表明hBDs能够调节炎症因子,对外周血中性粒细胞(peripheral blood neutrphils,PMN)的凋亡产生影响,Nagaoka I等[12]证明hBDs能够抑制PMN的凋亡,延长细胞周期从而防御病原菌入侵,其主要机制为hBDs尤其是hBD3可以激活人趋化因子受体(chemokine(C-C motif)receptor 6,CCR6),从而下调促凋亡蛋白truncated Bid的表达,上调抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达,同时抑制线粒体膜半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)的活性。另外,hBD2可以促进脐静脉内皮细胞管道形成,调节炎症反应时的血管生成。

5 β-防御素与趋化作用

β-防御素除了具有直接的抗病原微生物活性以外,还可以在天然免疫中发挥趋化作用。不同的防御素在特定浓度时可以选择性趋化天然免疫系统中的白细胞,通过吞噬方式来抵御和消灭入侵的病原微生物,hBD1趋化单核细胞,hBD2趋化肥大细胞,hBD3-4趋化巨噬细胞[13]。另外hBD2功能[14]类似于血管内皮生长因子,达到一定剂量后,促进伤口愈合以及内皮毛细血管的形成。

此外,防御素可以趋化非成熟的树突状细胞(immature dendritic cells,iDCs),在感染部位获取和递呈病原微生物抗原,启动特异性免疫应答。其中,β-防御素趋化作用是最强的,试验证明,hBD2、hBD3以及mBDs可以和CCR2相互作用介导趋化作用,Rohrl J等[15]体外试验表明,mBD4和hBD2对表达CCR6的小鼠细胞均有趋化作用。还有试验表明mBD2即使在LPS结合蛋白不存在的情况下,也可以通过上调共刺激分子CD40、CD80、CD86、MHCII、CCR7,直接作用于iDCs促进DC的成熟[16],mBD2介导的成熟DCs可以促进Th1的极化以及促炎症细胞因子的产生。

二硫键连键模式对β-防御素的趋化功能有重要意义[17]。真核表达hBD3活性研究表明,当所有半胱氨酸残基被替代以后,二硫键消失,hBD3趋化活性丧失。防御素的趋化作用具体机制尚不明确,目前主要有三种假设:替换配体模型、膜破裂模型、反式激活模型[18]。

6 β-防御素与Toll样受体

大量证据表明,防御素和T LRs有密切的联系,尤其是β-防御素和细胞外T LRs[19]。例如鼠的β-防御素2(murine beta defensin 2,mBD2)通过T LR4激活NF-κ B信号通路[20]。在转染TLR4和鼠髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2,MD2)的人胚胎肾细胞(human embryonic kidney,HEK)293中,mBD2可以激活NF-κ B,而不转染的NF-κ B则不能被激活。具体机制为mBD2是T LR4的内源性配体,可以介导树突状细胞(DC)的成熟。而人工合成的hBD3既可以激活DC又可以杀死DC。还有报道显示hBD3通过MyD88/IRAK/NF-κ B信号通路与T LR1和TLR2相互作用,激活专职抗原递呈细胞[21]。由此可见,β-防御素通过与受体相互作用,能够很好调节抗原递呈细胞的功能状态,从而发挥重要的免疫调节作用。

另外,活化的T LRs可以促进β-防御素产生并调节其活性。人胆管上皮的T LR2和TLR4的激活,不同程度的促进hBDs的产生,从而提高宿主抗隐孢子虫感染的能力。角膜上皮细胞经绿脓杆菌感染后,用低剂量鞭毛蛋白(T LR5激动剂)处理,结果不仅使hBD2的mRNA的表达量增加,TNF-α和IL-8分泌也增多[22]。同时Sumikawa Y等[23]通过鼠试验表明,脂多肽可以通过T LR2/MyD88依赖的信号通路,刺激角质形成细胞中mBD3的表达,提高TNF-α和IL-1α的分泌。

7 结语

细菌对抗生素的耐药性是当今临床医学中的全球性难题,开发新的抗感染药物势在必行。而β-防御素具有高效、广谱的抗菌作用,且不会产生耐药性和毒副作用,有很大的药用价值,同时对免疫细胞有趋化功能,参与免疫调节,可以作为佐剂调节机体免疫系统。虽然目前对于防御素的应用还有许多问题亟待解决,但是随着科技的不断进步,β-防御素的研究将不断深入,有助于阐明某些疾病的发病机制,并为开发新型抗菌药物提供理想的分子骨架和模板,给治疗一些顽固的感染性疾病带来新的希望。

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