细菌体内诱生抗原筛选技术的研究进展

吴苗苗,黄明明,陈友梅,李能章,王豪举

(西南大学动物科技学院,重庆400715)

病原性细菌侵入宿主并致病的过程是病原菌和宿主细胞互相作用的复杂过程,这一系列复杂的动态过程需要病原菌相应的毒力基因随着宿主体内环境的变化而得以表达或上调[1]。病原菌进入宿主体内所处的环境与体外差异极显著[2],为适应这种差异病原菌会自动调节相应的基因表达模式,即上调其在宿主体内生存起关键作用的基因和对侵染宿主有利的毒力基因的表达,而下调无关基因的表达。这种只在进入宿主体内后表达而在体外无法表达的基因,称为体内诱生基因(invivo induced gene)[3-5]。大量的研究表明,病原菌这种只在体内表达,而在体外不表达的独特的基因,不仅对病原菌在宿主体内的存活和病原菌的致病过程起到重要作用[6],而且也是良好的候选保护性抗原和理想的药物靶标。因此,对病原菌体内诱生抗原的研究和应用越来越受到重视,从而发展出了一系列筛选体内诱生抗原的方法,如体内表达技术(in vivo expression technology,IVET)、信号标签突变(signaturetagged mutagenesis,STM)、差异荧光诱导(differential fluorescence induction,DFI)、体外转座进行基因组分析和作图(genomic analysis and mapping by in vitro transposition,GAM-BIT)以及体内诱导抗原技术(in vivo induced antigen technology,IVIAT)等,本文就这几个抗原筛选技术做一综述。

1 体内表达技术

Slauch J M等用他们首次设计的体内表达技术(IVET)[7]成功鉴定出多种鼠伤寒沙门菌的体内诱生抗原基因。此方法的原理是启动子捕获策略,即将一定大小的病原菌基因组随机片段与无启动子的报告基因(如lacZ、抗生素抗性基因、营养缺陷等)融合,并将之整合到病原菌染色体上,通过构建动物模型从中选择那些只在体内表达融合报告基因而在体外不表达的菌株,就可以鉴定出病原菌进入动物体内被诱导的基因。研究者根据筛选目的的不同采用不同的报告基因,又分别设计出以下6种基于IVET的筛选方法。

1.1 营养缺陷型体内表达技术

此方法的原理是将病原菌所必需的管家基因作为报告基因,其缺陷型无法在宿主体内存活,用其报告基因的缺陷突变体为宿主,只要报告基因被激活,宿主就能存活。该方法最初是通过证明purA和thyA缺陷型无法在宿主体内存活,鉴定出鼠伤寒沙门菌的体内诱导基因。近年来有研究表明,asd或dapB基因参与二氨基庚二酸盐的生物合成[8]。

这种方法有两个缺点。首先,某些病原菌无法构建所需的营养缺陷型突变株;其次,产生的营养缺陷型突变株也可能导致病原菌无法存活。然而,只要能产生营养缺陷型突变株,并且该缺陷株无碍于病原菌的存活,营养缺陷型筛选的IVET就可以成为筛选体内诱生抗原的一个有力工具。

1.2 抗生素体内表达技术

针对某些无法构建营养缺陷型突变株的病原菌,可以采用抗生素IVET。已有研究者用不同的抗生素耐药基因进行研究,如用缺乏启动子的四环素耐药基因(tet)研究牙龈卟啉单孢菌侵入小鼠体内后的毒力,使用红霉素耐药基因研究猪链球菌侵染猪体内后的毒力,用卡那霉素的耐药基因研究出血败血性巴斯德菌、创伤弧菌[9],用氯霉素耐药基因(cat)研究幽门螺旋杆菌、鲁氏耶尔森菌、蜡样芽胞杆菌、大肠埃希菌,等入侵动物体后的毒力。

这种方法虽然避免了构建突变株的障碍,但其缺点在于:给予宿主抗生素有可能改变宿主的体内环境,从而对病原菌和宿主的互作产生影响;给药时间、给药浓度、给药方式等的不同可能造成的影响大小不同。

1.3 荧光酶体内表达技术

Hickey M J等[10]基于IVET技术设计了荧光酶体内表达技术(luciferase in vivo expression technology),用于研究重组分支杆菌报告菌株在小鼠体内抗分支杆菌的活性。主要针对某些生长缓慢和生物安全环境要求严格的菌株(如结核分支杆菌),进行体内诱生抗原的研究,该技术的应用,可以加速那些生长缓慢的病原菌的动物模型体内抗生素和免疫原评估的过程。

1.4 基于重组酶的体内表达技术

无论是营养缺陷型IVET、抗生素IVET还是荧光酶体内表达技术,都无法分离出短暂表达或表达水平低的体内诱生抗原。有研究者设计了基于重组酶的体内表达技术(RIVET)[11],该技术的原理是可筛选的基因融合系统(the screenable gene fusion system)。使用一种特定位点的DNA重组酶,当存在体内表达时,这种酶就会从细菌染色体中切除一种可选择的基因暗带,失去这种暗带后即可进行筛选或体外选择。如当IVET的载体与病原菌染色体发生同源重组以后,若无启动子的tnpR上游含有体内诱导基因的启动子,则tnpR将被激活,并催化染色体上tet两侧存在的res位点的特异性DNA序列进行反向重组,从而使tet被永久删除,即一旦tnpR表达,就会使病原菌由四环素耐药型转变为四环素敏感型,再通过影印平板法筛选出宿主体内分离的菌株。目前这种方法已经用于检测鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)[12]、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)[13]、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)等病原菌感染过程中体内转录诱导的基因,包括那些短暂表达或表达水平低的基因。此法还可用于监控感染过程中那些特定的基因在空间上和时间上的表达。

1.5 差异荧光诱导

Valdivia R H等[14]发现鼠伤寒沙门菌侵入小鼠体内后的存活和复制依赖于低的pH环境,为此,他们设计出差异荧光诱导(DFI)法,且用该方法成功鉴定出8个氨基酸诱导启动子,并发现这些区域的基因负责编码细胞表面保护酶,应力蛋白质组和广义外排泵。该技术的原理是捕获启动子策略,即将病原菌基因组的DNA与不带启动子的绿色荧光蛋白(gleen fluorescent protein,GFP)基因融合,于特定条件下(如低pH),GFP蛋白的活性将会被诱导的启动子激活并表达,同时通过启动子的富集作用除去组成型启动子,从而分离出诱导启动子。该技术与荧光激发细胞分选技术(fluorescence-activated cell sorting,FACS)结合使用,可对病原菌基因进行半自动高通量的筛选。肺炎链球菌(Streptococcus pneumonias)是第一个用DFI分离出毒力基因的革兰阳性菌。Wilson等采用与Valdivia和Falkow类似的筛选方法分离出了单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的毒力基因(actA)。目前,DFI技术已用于筛选大肠埃希菌K1、肺炎链球菌、结核分支杆菌、鼠伤寒沙门菌、麻风分支杆菌、金黄色葡萄球菌等多种细菌的体内诱生基因。

这种方法的优点在于可进行高通量半自动筛选,既可分离在体内诱导表达的毒力基因,也可分离在体外诱导表达的毒力基因,GFP的表达并不影响细菌的毒力,鉴定差异表达基因而不考虑基因的本底表达水平,同时筛选的敏感度也可通过改变荧光的阈值进行调节,重复性很高,绿色荧光使得基因表达的过程变得可以用肉眼观察。但是,GFP的使用依赖于低的pH环境,荧光团在有氧气存在时才会产生,而目前还没有发现GFP信号放大的方法或器具,荧光表达的强度对试验结果有影响,同时从感染组织器官分离的病原菌可能存在背景荧光颗粒,会对细菌分选和荧光的定量造成不同程度的影响。

1.6 系统特定阶段诱生抗原的筛选技术

此法是将IVET设计为启动子诱捕基因编码某种互作必需因子(病原菌与宿主在特定阶段相互作用必需的因子),从而筛选出病原菌和宿主发生相互作用后,在特定阶段诱导表达的基因。目前已有研究将此法用于分离根瘤菌与苜蓿共生时早期诱生的基因(bacA,gusA)[15]。

2 信号标签突变

Hensel M等[16]用感染鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)的小鼠作为模型,设计出信号标签突变(STM),并以此法鉴定出该菌新的致病基因,其原理是若在与病原菌侵染宿主致病过程有关的毒力基因中插入转座子,则产生的突变体会因为毒力基因的插入而失去活性,无法引发持续性感染,最终无法在宿主体内存活。STM技术就是先通过突变体文库感染宿主,而后对存活的突变体进行负筛选即可鉴定出病原菌相关的毒力基因。目前,STM技术已用于30种以上的病原菌,筛选出了大量的转座插入突变体,并鉴定出1 700多种病原菌的基因(包括毒力基因)。

此法的优点在于可在体内对毒力基因进行鉴定,对致病过程而言,在体内的研究鉴定方法比体外的方法能够更真实的反应病原菌与宿主之间的相互作用。此法可对突变体文库进行负筛选,即该检测能够在毒力作用减弱甚至丢失的系统中进行,可进行高通量筛选。但是此法也存在以下缺点,STM技术依赖于混合菌体在宿主体内的增殖能力,当突变体不能被同一接种物中其他病原菌反式互补时,才可对病原菌的毒力进行鉴定;同时该技术必须以患病的动物模型为筛选体系,人为构建的动物模型,不能真实地再现病原体与原宿主之间相互作用的所有特征,而有些病原菌引发的疾病需要建立不同的动物模型。有些模型会绕过疾病的特定阶段,而无法鉴定到被绕过阶段的毒力因子。

3 体外转座进行基因组分析和作图

Akerley B J等[17]提出体外转座进行基因组分析和作图(GAM-BIT),并用该方法检测了流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的某些已知功能的必需基因和一些未知功能的开放阅读框(ORF)。此法原理与STM相同,也是一种负选择的方法。此法中,对一段由PCR扩增出来的病原染色体上的特异区域进行体外转座子的随机突变,收集所有突变的DNA并将其导入病原菌中,令其在选择性条件中(宿主体内)生长,然后用在这段染色体特异区域上的引物与转座子特异的引物组成引物对,最后对选择后存活的病原菌进行PCR检测。由于在基本基因中插入了转座子的病原菌无法存活,所以缺少基因组上基本基因对应部位的PCR产物,故而在PCR电泳结果图谱中即可定位基因组上的基本基因。此法的优点在于可以在那些比体外丰富的培养基环境严格得多的环境中(如宿主体内的环境)鉴定病原菌生长存活的必需基因。近年来,该方法已成功用于流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和酿酒酵母菌等病原菌的基本基因的鉴别[17-18]。此法最大的优点在于虽然是应用在基因组水平的分析,但其仍然可以针对研究者感兴趣的某段染色体区域或特定的DNA元件进行操作(如毒力岛、噬菌体等),但这种方法也需要建立相应的动物模型。

4 体内诱生抗原技术

由于某些病原菌缺乏适当的动物模型,Handfield M等[19]在研究口腔病原菌伴放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)时设计提出了不需要建立动物模型的体内诱导抗原技术(IVIAT)。该方法通过对表达文库进行免疫筛选得到病原菌的体内诱生基因。具体过程为:收集并挑选效价较高的感染过目标病原菌的宿主血清;先后用体外培养的病原菌全菌体及其超声裂解产物和热处理后的超声裂解产物对收集的血清进行充分的吸附处理,以去除血清中针对病原菌体外表达的抗体亚群,血清中残留的即为那些只在宿主体内表达的抗体亚群;然后提取病原菌的基因组并选择适当的表达载体构建病原菌的基因组表达文库,接着用吸附处理后的血清对表达文库进行检测,从而筛选得到体内诱生基因。

Handfield M等[19]首先利用IVIAT技术发现了116个体内诱生抗原,通过序列分析分为不同的功能类群,并从中得到11个体内诱生基因,他们还对此进行了进一步的研究,发现这些新的体内诱生基因编码的产物可以作为疾病的诊断标志。Deb D K等[20]也鉴定出了6个开放阅读框(ORF),并通过同源性分析推测其可用来开发为诊断工具或作为药物的潜在靶标。宋洁等[21]用IVIAT技术成功筛选得到5个猪链球菌2型的阳性克隆,该菌可能较以往的毒株有重要突变,具备很强的致病能力及体内生存能力[22-23]。目前此法已被用于肺炎链球菌、白假丝酵母、O 157∶H 7型大肠埃希菌、单核细胞增生李斯特菌、霍乱弧菌[24]、流产布鲁菌[25]、链球菌[26]、炭疽杆菌[27]等病原菌体内诱生抗原的筛选。此法的优点在于可用于研究不同感染阶段病原菌可能产生的不同抗原,不需要使用动物模型,简单快捷,可检测瞬时基因表达和病原菌感染的不同阶段。缺点在于只能鉴定那些可培养的病原;而且有些病原在宿主体内没有免疫原性,这样的抗原就无法用IVIAT进行鉴定;此法也会受到免疫交叉反应的影响而造成假阳性;并且IVIAT技术无法分辨出那些在体外和体内都表达的病原基因。

5 展望

IVET、STM、GAM-BIT和IVIAT四种方法都是研究体内诱导基因非常有价值的工具,针对性不同而各有差异及优缺点,但这些方法都有利于体内诱生基因的研究,对阐明病原菌的致病机理有很大帮助,彼此存在互补。IVET是一种启动子捕获策略,基于IVET法的DFI可以通过观察绿色荧光而观察基因表达的过程。STM是一种基于转座子的突变技术,利用这些转座子对细菌进行随机突变以及动物模型的体内筛选,但与IVET不同,STM不需考虑基因的表达问题。使用GAM-BIT的研究者可以对其感兴趣的某段染色体区域或特定的DNA元件进行操作(如毒力岛、噬菌体等),而其他方法则不能。前三种方法可分辨出体内诱生抗原和那些在体内和体外都表达的病原基因,并且只适用于有合适的动物模型的病原菌如伤寒沙门菌等。

而IVIAT适用于没有适当的动物模型的病原菌如肺炎链球菌、结核分支杆菌、霍乱弧菌等,具有简单、快捷、高通量,可检测感染不同时期的差异基因,发现很多以前未曾发现的体内诱生基因等多项优点,近年来作为一项新型的病原菌体内表达基因检测技术,广泛运用于多种病原菌的研究。IVIAT的应用可以帮助我们更准确地阐明病原菌的毒力因子和致病机制,为抗菌药物的开发、临床诊断试剂的研究、疫苗的设计提供新的准确靶标,从而为预防和治疗工作奠定基础。

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