RCC1、EGFR与K-ras在NSCLC治疗中的进展

张晶晶，吕喜英

(承德医学院，河北承德 067000)

肺癌居癌相关性死因首位，非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%-85%，非小细胞肺癌的发病率和死亡率呈上升趋势，化疗仍是晚期NSCLC最重要的治疗方式，而其标准一线化疗方案(含铂的第三代二联化疗方案）的有效率仅为25%-35%。总体而言，肺癌患者的预后仍较差。当今，NSCLC患者个体化治疗中，利用分子标志物预测预后和指导治疗成为研究热点，通过检测分子标志物指导个体化治疗，能够选择最有效的治疗策略，使疗效最大化，最大程度降低毒性，从而改善预后。本文就核苷酸切除交叉互补基因1(ERCC1）、表皮生长因子受体(,EGFR）、原癌基因Kirsten-Rous肉瘤病毒(K-ras）与NSCLC的相关性研究进展作一综述。

1 ERCC1

ERCC1基因在胞内DNA复制及损伤修复环路中起关键作用，是被人类首个克隆而得的DNA损伤修复基因[1]，位于19q13.2-13.3,全长15kb，含10个外显子，被转录加工为1.0kb mRNA和1.1kb mRNA，仅后者编码含297个氨基酸的蛋白质，ERCC1-XPF异二聚体具有5，DNA核酸内切酶活性，具有损伤识别和切除5，端的双重作用，在核苷酸切除修复系统(NER）中起到限速或调节的作用[2]，其活性高低可反映NER修复活性水平[3]。核苷酸切除修复是最重要的DNA修复途径，是一种无误性修复方式，是维持体内DNA结构完整和稳定的主要方式。在人类细胞中，由化学药物造成的DNA损伤主要通过NER途径修复，而ERCC1在NER途径中起关键作用。铂类药物抗肿瘤作用的主要靶点为DNA，其细胞毒性主要在于与细胞内亲核DNA结合，形成铂-DNA加合物，影响DNA复制转录，导致其致命损伤。NER是DNA修复机制中最全面性的，该系统被认为是引起顺铂耐药的主要原因之一，而ERCC1基因在NER过程中起着关键作用。ERCC1可较好反映对顺铂、卡铂、奥沙利铂等类化疗药物的耐药情况，最初研究发现在胃癌、食管癌中ERCC1与顺铂耐药相关，随后该现象同样存在于NSCLC中。铂类可使快速增殖细胞停滞于细胞周期某一阶段，而ERCC1过表达可使停滞在G2/M期的损伤的DNA迅速修复，导致其对铂类耐药。

1.1 ERCC1与NSCLC 肺癌高居恶性肿瘤首位，并且全球肺癌发病及死亡人数呈逐年上升趋势，其死亡率已占癌症死亡率之首，其中非小细胞肺癌(NSCLC）占肺癌85%。早期NSCLC患者一般手术切除，但30%-60%的患者仍会复发并可能死亡。临床研究已验证，顺铂辅助化疗可以提高术后NSCLC的生存期。对NSCLC患者术后行辅助化疗目前已为标准，但总生存率仅能提高4.1%左右，可见多数患者并未得益于术后化疗。筛选出可能从中获益者以使多数未获益者免受化疗带来的副作用，这将是当今肺癌研究的热点。目前，以铂类为基础联合第三代新药(异长春新碱、紫杉醇、吉西他滨、培美曲塞）的化疗方案是非小细胞肺癌(NSCLC）的标准一线方案，其有效率仅为25%-35%，NSCLC化疗疗效进入尴尬的“瓶颈”阶段，因此，对于不同特点的患者群予以针对性的治疗，使疗效达到最大化的个体化治疗是突破目前疗效“瓶颈”的根本所在，这必将是一项任重而道远的任务。

顺铂药物的毒性来自于cisplatin与DNA的结合。Cisplatin-DNA共价复合物影响细胞的基本过程，包括DNA修复、细胞周期阻滞及细胞凋亡。ERCC1基因在胞内DNA复制及损伤修复环路中起关键作用，较早在一些肿瘤细胞中的研究表明[4]:ERCC1 mRNA表达显著减弱，提示核苷酸切除修复能力降低，增加细胞癌变几率。同理，ERCC1低表达促进肺癌的发生发展，吕嘉春[5]与张增利等[6]通过检测ERCC1基因mRNA和其基因多态性分布，结果均显示ERCC1低表达可作为肺癌易感性标志。

Simon等[7]根据ERCC1和RRM1基因表达水平对晚期NSCLC进行选择性用药的前瞻性Ⅱ期研究，结果证明ERCC1低表达者用铂类治疗，ERCC1高表达者用非铂治疗，提高肺癌治疗的有效率。Cobo等[8]的研究是第一次根据ERCC1 mRNA表达水平进行选择性应用铂类药物的多中心、随机Ⅲ期对照试验，结果提示，依据ERCC1 mRNA表达水平对铂类进行选择性用药好于非选择铂二联的传统治疗模式。Olaussen等[9]应用标准免疫组化法检测IALT研究患者的ERCC1蛋白表达和铂类疗效的关系，显示仅ERCC1蛋白低表达者才受益于顺铂辅助化疗，ERCC1蛋白高表达提示对铂类耐药。Reynolds等[10]针对晚期NSCLC的Ⅲ期试验回顾性研究发现，用定量荧光免疫组化法检测的ERCC1蛋白表达与铂类方案疗效呈负相关。上述研究均提示ERCC1蛋白表达水平也能够预测铂类方案的疗效。

Zheng等[11]研究了187例早期NSCLC病人的手术标本和患者预后的关系，发现ERCC1高表达病人生存期长，并可作为早期NSCLC手术后预后决定因子。Simon等[12]采用RT-PCR法检测了51例完全手术切除的Ia-Ⅲb期NSCLC瘤内ERCC1 mRNA相对表达水平，结果发现ERCC1表达与患者预后呈正相关，Cox分析示ERCC1高表达是NSCLC术后生存良好的独立预后因素。Ceppi等[13]用PCR方法检测进展期NSCLC病人的ERCC1 mRNA表达水平，Cox分析明确ERCC1可作为独立预后因素。上海市胸科医院韩宝惠等采用免疫组化方法检测了152例根治性手术后有长期随访I-Ⅲa期NSCLC患者手术标本ERCC1的表达水平[14]。认为:①I期NSCLC患者存在ERCC1高表达，是术后预后良好的独立指标。②ERCC1表达对I期和Ⅱ-Ⅲ期NSCLC术后生存具有双重效应:ERCC1高表达减少了术后肿瘤复发的危险但同时对DDP耐药，I期NSCLC术后ERCC1高表达发挥更多的是其保护的一面，而Ⅱ-Ⅲ期以铂类耐药或抵抗为主。

1.2 NSCLC的分子靶向治疗 肺癌分子靶向治疗是指在分子生物学基础上，将与肺癌发生、发展、预后等密切相关的特异分子作为靶点[15]，利用靶分子特异制剂或药物进行治疗的方法。靶向治疗可特异性杀伤肿瘤细胞，对正常细胞几乎无损伤作用，与传统治疗相比对机体损伤小，患者耐受力好，是理想的治疗方法。KRAS和EGFR基因突变是肺癌中最常见的突变。KRAS密码子12和13的突变在肺腺癌中的突变率为20%-25%，在其它NSCLC中突变率较低;EGFR在40%-80%的NSCLC中过表达，尤其在非吸烟女性肺腺癌中高发。

近年肺腺癌领域出现的重要分子事件:EGFR突变是晚期肺腺癌一线EGFR-TKI治疗的疗效预测因子;EGFR突变的肿瘤演变有惰性缓慢的特征;EGFR突变和K-ras突变在同一肿瘤中互斥(几乎不会同时出现）;对于EGFR和K-ras突变均为阴性的患者，其携带EML4-ALK融合基因的可能性很大。NSCLC治疗的分子靶向药物主要有两类，一类是作用于肿瘤细胞内的小分子TKIs，包括Gefitinib(吉非替尼)和Elrotinib(厄洛替尼）;另一类是作用于细胞外的单克隆抗体，主要是Cetuximab(西妥昔单抗），均作用于肿瘤细胞的EGFR信号传导通道，而EGFR信号系统参与肿瘤侵袭、血管生成、凋亡障碍和化放疗抗拒[16]。

2 EGFR

EGFR基因位于7p12-14区，由28个外显子组成。EGFR由1186个氨基酸残基组成，是一种分子量为170kDa的膜蛋白，由1个胞外配体结合区、跨膜区和1个具有酪氨酸激酶(TK）活性的胞内区组成。是跨膜受体酪氨酸激酶ErbB家族的一员，属于I型生长因子受体家族。EGFR家族包括:ErbB1(EGFR）、ErbB2(HER2）、ErbB3(HER3）、ErbB4(HER4），同属于受体酪氨酸激酶(RTKS）。EGFR与相应配体表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)等结合后，自身发生磷酸化而激活，并启动下游一系列级联酶促信号转导通路，其中最重要的两条通路分别是Ras-MAPK(丝裂原激活蛋白激酶）通路和PI3K(磷脂酰肌醇-3-激酶）/Akt通路，与细胞增殖、细胞凋亡等密切相关。据报道:肺癌细胞以自分泌方式分泌TGF及GF，可与EGFR结合发生作用，并且EGFR的表达与肺癌患者预后密切相关。

2.1 EGFR突变 目前有3种方法用于明确肿瘤细胞的EGFR状态，包括分析基因突变、检测基因拷贝数和EGFR表达水平。敏感相关性突变:最常见的为外显子19缺失(E19 de1)和外显子21 L858R突变，激活酪氨酸激酶结构域，且都与肿瘤对小分子TKIs的敏感度高度相关。这些突变见于18.4%-36.8%的亚洲NSCLC患者,远高于欧美地区[17]。①外显子19碱基缺失，突变主要发生在以LREA为中心的第746-752位密码子的碱基缺失，突变的EGFR蛋白改变了受体ATP结合囊(ABP)角度，显著增强了肿瘤细胞的敏感性;②外显子2l的点突变，主要是第858位密码子出现T-G转换，该位点编码的氨基酸由亮氨酸转变为精氨酸(L858R)，位于DGF序列附近，其作用使A-loop的稳定性增强，提高了肿瘤细胞对EGFR-TKIs的敏感性。DEAL-1和DEAL-2两项临床试验发现，吉非替尼治疗亚洲非吸烟的女性肺腺癌患者效果较好，主要原因与这些妇女出现敏感相关基因突变频率较高密切相关，89%的突变集中在l9外显子的缺失和21外显子的L858R点突变[18]。

耐药相关性突变与TKI耐药有关，分为原发耐药和获得性耐药，前者与K-ras突变、EML4-ALK融合基因相关。后者的主要相关因素为T790M二次突变及c-MET基因扩增，二者所占比例分别为50%及20%左右。近期研究表明，还可能与MET配体肝细胞生长因子(HGF)高表达有关。对于因T790M突变导致TKI耐药的NSCLC，可给予不可逆性的多靶点抑制剂。期待新型选择性c-MET抑制剂的临床研究，需进一步证实HGF与TKI耐药相关性的临床研究。①外显子20点突变，主要是第790位密码子出现C-T转换，该位点的氨基酸由苏氨酸转变为甲硫氨酸(T790M)，T790M突变可发生在治疗前、中和后。研究发现，患者治疗前检测出对药物敏感的EGFR基因突变，但在吉非替尼治疗一段时间后，病情恶化，通过对治疗后的肿瘤组织分析证实，患者出现了“获得性”T790M突变。②外显子20碱基插入突变发生在第770-775位密码子，在GACAACCCCCACGTGTGC序列间(主要在CCCCC序列两侧)存在8种不同的插入方式，插入的片段为3-9个碱基。提示存在EGFR-TKIs敏感相关突变基因的患者，在药物治疗过程中也可能产生耐药突变基因的亚克隆，对这些耐药基因突变的检测有助于及时判断疗效，选择最佳治疗方案。部分患者在治疗前肿瘤组织中就存在T790M突变，这可能导致对吉非替尼的“先天性”耐受。因此，在治疗前和治疗中检测EGFR T790M突变状态可以预测TKIs的治疗效果。药物活性选择性基因突变，主要指基因突变后对某一类药物敏感，但对另外一类药物产生耐药。常见的药物活性选择性基因突变发生在EGFR外显子22，当外显子22出现E884K突变时，患者对吉非替尼敏感，但对另一种EGFR-TKI厄罗替尼耐药;当同时伴有L858R突变时，患者对吉非替尼和厄罗替尼敏感度都有所增加[18]。

棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)编码蛋白N-末端部分融合至间变淋巴瘤激酶(ALK)的细胞内酪氨酸激酶结构域，重排为EML4-ALK，导致异常酪氨酸激酶表达。2007年，Soda[19]首次在NSCLC患者术后标本中检测到EML4-ALK重排融合。此后相继有报道，如果不吸烟或仅少量吸烟者，或不伴有EGFR基因突变者，EML4-ALK阳性率分别高达22%和33%。EML4-ALK阳性者的某些特征与EGFR突变者相似，阳性几乎出现在不吸烟或轻度吸烟及腺癌患者中，不能从EGFR-TKI靶向治疗中获益。Crizotinib(PF02341006)是针对ALK基因的小分子抑制剂，Bang等[20]在2010年ASCO年会上报告了Crizotinib治疗晚期NSCLC的临床研究结果，研究者认为，对于携带EML4-ALK融合基因的NSCLC患者，Crizotinib治疗的缓解率高且安全性良好，或可成为首选标准治疗用药。

2.2 EGFR抑制剂 Cetuximab是一种人鼠嵌合抗EGFR的单抗，竞争性抑制EGFR与EGF和TGF-α结合，阻断EGFR的激活和其下游信号通路蛋白的磷酸化，并下调胞膜表达水平，此外可激活抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)，产生细胞杀伤效应;EGFR-TKI包括厄洛替尼(Erlotinib)和吉非替尼(Gefitinib)，通过与(adenosine triphosphate, ATP)竞争性结合EGFR的胞内区直接抑制EGFR-TK并间接降低周期抑制蛋白p27的表达，使癌细胞阻滞于G1期并诱导凋亡等，达到延长肿瘤患者生存期的目的[21]。对于未检测EGFR突变状态的群体，亚裔非吸烟的女性肺腺癌患者是EGFR-TKI治疗的优势人群。而对于EGFR突变的高选择群体，IPASS、SLCG、NEJGSG 002、WJTOG3405 等研究显示,一线接受TKI治疗有效率为70.6%-74.5%，中位生存期(PFS）为10.6-14.0个月。由于最终几乎所有的患者都会对EGFR-TKI产生耐药，限制了其长期疗效。EGFR-TKI联合标准含铂一线化疗方案亦不能额外改善患者生存率[22]。

2.3 K-ras K-Ras基因属于Ras原癌基因家族，位于染色体12p11.2，其家族还包括H-Ras和N-R as，每个基因各有4个外显子。K-Ras基因突变主要集中于外显子1中第l2、13位密码子和外显子2中第61位密码子，最常发生在第l2位密码子，K-Ras基因l2位密码子野生型为GGT，突变型常为TGT、GTT、GAT三种，基因突变产生具有致癌活性的p21蛋白。K-ras基因是EGFR通路下游的效应子，突变型K-ras促进肿瘤细胞生长扩散，且不受上游EGFR信号影响。K-ras基因突变是靶向药物原发性耐药的重要预测指标，是EGFR-TKI治疗的负性预测因子[18]。Meta分析总结1008例NSCLC患者的TKI治疗效果，结果NSCLC患者K-ras突变为16.4%-21%，有吸烟史者远高于无或少量吸烟者(25%vs 6%)，腺癌高于其它组织学类型(26%vs16%)。K-ras突变患者接受TKI治疗的有效率约3%，而K-ras野生型患者其有效率近26%[23]。故2009年版NCCN指南推荐:存在K-ras突变的患者建议选择厄洛替尼以外的其它治疗，推荐级别为2B类。

3 EGFR、K-ras与NSCLC

国际肺癌研究学会、美国胸科学会和欧洲呼吸学会(IASLC、ATS、ERS)联合推出了肺腺癌的国际多学科分类新标准。该标准推荐，应对晚期肺腺癌患者进行EGFR突变的分子检测，这是基于包括IPASS、OPTIMAL等多项临床试验的高级别证据。EGFR突变筛选出的肺腺癌患者一线接受EGFR-TKI治疗，有效率>70%，而未经EGFR突变筛选者的总体治疗有效率仅为30%。总之，对于EGFR敏感突变的患者，使用EGFR-TKI治疗是合理的选择，而对于无敏感突变的患者，采用EGFR -TKI治疗是有害的。EGFR突变和K-ras突变在同一肿瘤中互斥(几乎不会同时出现），K-ras基因突变是靶向药物原发性耐药的重要预测指标，是EGFR-TKI治疗的负性预测因子。2010年ASCO年会报道了BATILE研究的初步结果，提示K-ras基因突变型或EGFR基因野生型的患者可能从索拉非尼治疗中获益，而EGFR基因突变阳性及EGFR基因拷贝数扩增的患者其接受索拉非尼治疗效果可能欠佳[24]。该研究为K-ras突变及野生型、EGFR野生型患者提供了治疗机会，但此研究仅为小样本Ⅱ期临床研究，尚待大规模的临床研究验证。随后研究得到对于EGFR和K-ras突变均为阴性的患者，其携带EML4-ALK融合基因的可能性很大，Crizotinib(PF02341006）是针对ALK基因的小分子抑制剂，其缓解率高且安全性良好，或可成为首选标准治疗用药。

4 ERCC1、EGFR、K-ras与NSCLC

ECOG1594研究显示:NSCLC的标准一线化疗方案以铂类为基础，联合第三代新药。而对于ERCC1高表达患者预示对铂类耐药，此类患者应用铂类化疗弊远大于利，故对于NSCLC尤其肺腺癌患者，检测EGFR突变状态指导EGFR-TKI治疗尤为重要，不能仅根据优势人群选择TKI治疗。若EGFR突变阳性且无论ERCC1高低表达，提示可一线选择EGFR-TKI治疗，然而对于K-ras突变型肺腺癌患者，往往提示EGFR-TKI治疗效果欠佳。由于EGFR与K-ras几乎不会出现在同一肿瘤组织中，故结合ERCC1，可选择合适的化疗方案(EGFR-TKI联合标准含铂一线化疗方案亦不能额外改善患者生存率）。对于早期NSCLC患者，ERCC1阳性未化疗组生存期较ERCC1阴性未化疗组长;对于晚期NSCLC患者，ERCC1阳性化疗组(含铂方案）生存期较ERCC1阳性未化疗组短;ERCC1阴性化疗组(含铂方案）生存期较ERCC1阴性未化疗组长;ERCC1阴性化疗组(含铂方案）生存期较ERCC1阳性化疗组(含铂方案）长;对于EGFR突变阳性，尤其是K-ras突变阴性且ERCC1阳性的晚期病例，EGFR-TKI靶向药物是一线治疗方案，能够显著提高疗效及延长生存期;对于EGFR突变阴性，K-ras阳性，若ERCC1阳性则选择不含铂方案，若ERCC1阴性则可选择含铂方案。JMDB研究奠定了培美曲塞在肺腺癌中的化疗地位。ECOG4599研究显示:对于未检测EGFR突变状态或非突变的腺癌患者，贝伐珠单抗联合化疗是目前最具疗效优势的方案。

5 亟待解决的问题

21世纪，基于生物标志物与遗传学特征的肿瘤个体化治疗及研究方兴未艾，尤其在NSCLC治疗中显示良好应用前景，然而存在以下问题:(1)多数研究仍为回顾性分析，由于临床基线情况不均衡而影响试验结果，需高级别多中心、随机对照前瞻性临床试验验证;(2)检测技术的准确性、先进性、可行性，即标准化，检测的敏感性，设定合适分子标志物高低表达划分点，标本处理等是确保其临床应用的前提;(3)常选用组织标本，但对于晚期患者，经穿刺得标本量少，信息不完整，IPASS、FLEX等研究显示组织标本检测有效率仅为30%-40%。另外，肿瘤生物学特性在治疗中发生改变，而实时获取组织标本难上加难。需寻找其替代品，外周血能否替代组织标本尚不明确，存在的问题:首先血液与组织标本检测结果的一致性报道不一，待多中心、大样本、前瞻性研究证实;其次肿瘤细胞或游离DNA能否代表原发灶DNA水平，需进一步研究。

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