促凋亡蛋白NIX的研究进展*

黄 一,吴秋平,陈小波综述,闵家新审校

（第三军医大学新桥医院胸外科,重庆400037）

细胞凋亡又称为程序性细胞死亡,是多细胞生物维持生长发育和组织形态所特有的,由多种基因参与表达、精密调控的细胞主动死亡过程。NIX是近年来发现的隶属于Bcl-2家族中的BH3-only促凋亡家族成员。虽然具有Bcl-2家族特征性的BH3域和羧基末端跨膜结构域（TM）,也能与Bcl-2形成二聚体,但NIX的促凋亡活动明显不同于其他Bcl-2家族成员,本文通过对NIX的促凋亡功能机制以及其在细胞自噬、线粒体自噬、肿瘤及心肌疾病发病机制等方面的研究进展作一综述。

1 NIX的发现和特征描述

NIX又称Bcl-2/E1B 19kDa-interacting protein 3-like,是基于与BNIP3存在56%的同源性,由人胎盘cDNA文库中克隆而来。与BINP3类似,NIX编码产物含有Bcl-2的BH3和TM结构域,属于BH3-only促凋亡家族成员,能与Bcl-2、Bcl-X1、E1B19K等蛋白相互作用,促使细胞色素C的释放,从而促进细胞凋亡。研究表明,NIX定位于线粒体,并可以在短暂表达的同时诱导细胞凋亡,Bcl-2和Bcl-XL在NIX诱导的细胞凋亡中起保护作用,NIX对蛋白酶依赖性降解非常敏感。因此，NIX和BNIP3享有几个共同的主要特征,包括与Bcl-2和Bcl-XL的相互作用,通过羧基端跨膜区诱导细胞凋亡,具有与BNIP3类似的促凋亡能力。

2 由缺氧诱导的促凋亡蛋白

正常组织中不能检测到NIX基因或蛋白。在多种细胞系的体外培养缺氧诱导实验中发现,NIX启动子含有功能性缺氧反应元件（HRE）,是缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的直接靶基因,在缺氧条件下细胞内NIX mRNA水平及NIX蛋白水平升高,从而诱导细胞凋亡过程[1-3]。

早期研究发现,在缺氧条件下,除了一些共知的缺氧调节基因有表达变化之外,NIX mRNA表达水平也有较明显的升高现象。在缺氧条件下,NIX mRNA表达水平迅速升高,达正常条件时5倍之多。NIX的表达不但由HIF-1α诱导,也由转录因子早期生长反应因子（EGR2）和p53诱导表达[4-5]。EGR2是一种肺创伤后高表达的转录因子[6]。p53不但与肿瘤抑制相关,现更多的研究集中在其作为转录因子方面。这些研究表明,NIX在缺氧介导的细胞凋亡的病理进展中有着特殊作用。

3 NIX诱导的细胞凋亡机制

NIX诱导细胞凋亡的分子机制目前尚不清楚。多项研究表明,NIX诱导的细胞凋亡并不是通过单一机制,而是根据细胞类型和实验条件的不同,存在多条通路。关于NIX的促凋亡活动,也与BNIP3非常相似,尽管它属于Bcl-2家族,也能与Bcl-2形成二聚体,但是它促凋亡的活性明显不同于Bcl-2家族的其它成员。目前认为NIX与线粒体膜结合后引起线粒膜通透性孔开放,线粒体内膜跨膜电位（△Ψm）降低,活性氧增加,引起细胞死亡。NIX诱导细胞凋亡不依赖于Caspases、细胞色素C的释放,而与它跨膜结构域 TM有关。NIX引起的细胞死亡发生时间较典型性凋亡晚,一般在缺氧72h后发生,它引起浆膜和线粒体的损伤,引起染色体DNA断裂成大分子片段,呈现非典型性凋亡的特点[7-8]。

NIX属于典型的BH3-only蛋白,但多项研究表明NIX并非通过依赖细胞色素C和Caspases的释放,最终激活DNA断裂因子40（DNA fragmentation factor 40,DEF40）引起染色体DNA断裂成小分子片段这一典型的细胞凋亡通路诱导细胞死亡：（1）与典型的BH3-only蛋白比较,NIX诱导细胞凋亡的能力较弱[9]；（2）典型的BH3-only蛋白通过细胞色素C的释放,不依赖于1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）而引起细胞死亡,而NIX诱导细胞凋亡的过程中含有MPTP的开放；（3）典型BH3-only蛋白的促凋亡活动高度依赖于BH3结构域,而NIX的促凋亡活动主要由TM所决定；（4）与典型的BH3-only蛋白诱导的细胞凋亡相比,NIX诱导的细胞凋亡在形态学上有着明显的不同。并不排除典型细胞凋亡机制参与NIX诱导细胞凋亡的可能性,然而,它却难以解释依赖于MPTP这一主要途径的存在。

最近的一项研究为NIX诱导细胞死亡的第3种潜在机制提供了证据[10]。Bax/Bak、Bcl-2对于细胞凋亡有相反作用的影响,至少部分影响内质网/肌质网（ER/SR）的钙池、线粒体的钙摄取和M PTP[11-12]。在这项研究中,NIX的过表达及抑制分别表现为心肌细胞ER/SR钙池水平的升高和降低。通过遗传消融去除对ER/SR钙吸收泵的抑制,恢复钙池水平,可以逆转因NIX缺乏而对由Gaq介导的心肌疾病造成的有利影响。此外,定位于内质网的NIX可导致线粒体膜的去极化和细胞凋亡。这个机制是否与非心肌细胞有关尚待研究。

4 细胞自噬

NIX除了参与细胞凋亡以外,另一个有趣的方面是NIX的蛋白质生物学特性在细胞自噬中的作用。细胞自噬最初被认为是基于细胞的超微结构特性,特别是包绕细胞质和细胞器的双模结构,被称为自噬体。细胞自噬是有机体内原始的分解代谢程序,是机体一种重要的防御和保护机制。细胞可以通过自噬和溶酶体,消除、降解、消化受损和变性,以及衰、老失去功能的细胞、细胞器和变性蛋白质与核酸等生物大分子,为细胞的重建、再生和修复提供必需原料,实现细胞的再循环和再利用[13]。

Daido等[14]在研究由神经酰胺介导的恶性神经胶质瘤细胞的自噬过程中,首次描述了BNIP3在细胞自噬中的作用。在这个过程中,神经酰胺诱导BNIP3表达增高,而BNIP3造成线粒体除极化和自噬。在另一个缺血再灌注模型中,BNIP3通过诱导细胞自噬而保护HL-1心肌细胞[15]。同样,缺氧诱导的BNIP3表达可导致细胞自噬,但却可保护骨肉瘤细胞免于坏死[16]。另外,细胞自噬与肌萎缩的发病机制有关,BNIP3和NIX在其中起着正调节的作用,他们在骨骼肌中的表达都可以诱导自噬体的形成[17]。

因此,BNIP3和NIX具有双重特性,他们既诱导细胞凋亡,也参与诱导细胞自噬。由BNIP3和NIX诱导的细胞自噬在某些情况下具有保护作用,然后他们又与自噬性细胞凋亡有关。关于后者,目前尚不清楚这种细胞凋亡是由于过度的细胞自噬造成,还是由BNIP3或NIX诱导的独立的细胞凋亡形式。

5 NIX与心肌疾病

国外研究发现,Bcl-2家族成员在心肌疾病的病理生理过程中起着重要作用。不同于BNIP3在新生小鼠心肌细胞中由缺氧诱导引起细胞凋亡的过程[18],NIX是由与心肌肥大有关的细胞信号所调控的,即心肌细胞中的Gaq信号肽和蛋白激酶钙通过结合在NIX启动子上的SP1位点,对NIX产生调控作用。通过近几年的研究,NIX在心肌细胞凋亡方面的作用已经在体内得到证实,NIX在心肌细胞中的高度表达可导致致命的新生儿围生期心肌病。然而,对于被去掉羧基端,存在线粒体定位缺陷的NIX,却可以对Gaq高表达的新生儿产生相反的保护作用[2]。并且,通过对小鼠的研究发现,NIX缺失可保护由Gaq介导的压力负荷型心脏病[1]。因此在心肌疾病中，BNIP3和NIX介导的细胞凋亡通路是由心肌缺血、缺氧以及心肌肥大所调节的。

6 NIX与肿瘤

NIX与缺氧介导的肿瘤细胞凋亡有关。在对缺氧条件下的中国仓鼠卵巢K1细胞的减除杂交法（subtractive hybridization）实验证明,缺氧可诱导NIX mRNA高表达。此外,NIX蛋白也被缺氧诱导,并与细胞凋亡有关。NIX启动子中含有两个HIF-1α结合位点,其中涉及编译启动密码子的-234位点是缺氧和HIF-1α反式激活所必需的。缺氧对于肿瘤是负面的预后指标,因而NIX的异常表达与侵袭性疾病有关[19]。Fei等[4]通过对体外培养的肿瘤细胞移植入动物体内模型的研究发现,NIX被沉默的肿瘤细胞在缺氧条件下生长的速度比含有正常NIX的肿瘤细胞快,NIX在转录中和转录后期由缺氧诱导因子HIF-1α和p53参与调节,而且NIX是Bcl-2家族中缺氧条件下惟一表达升高的抑癌基因。p53是具有代表性的肿瘤抑制基因,在压力条件下（如放射、化疗以及组织缺氧）,p53能正常清除肿瘤,然而组织缺氧也能够诱导p53发生突变,失去抗肿瘤的能力。NIX不像p53的其他调控基因（Puma、DRS、Bax或p21基因）,在缺氧条件下,仍然有被p53诱导激活的可能性。DNA损伤后,NIX表达受到p53的调控,p53通过其特异性的DNA结合片段,结合到NIX基因上,通过激活NIX的转录而直接调控NIX的表达。同时NIX在缺氧环境下反过来介导p53依赖的细胞凋亡进程。在肿瘤移植的动物模型中,实验性下调NIX的表达,可以加速肿瘤细胞生长。国外文献报道在多种肿瘤细胞系中发现HIF-1α诱导BNIP3、NIX表达上调。Sowter等[3]和Guo等[20]采用原位杂交方法,发现BNIP3、NIX在乳腺癌组织中表达上调,且表达见于坏死区周边区域。

这些研究结果表明,缺氧可通过BNIP3、NIX等因子对肿瘤细胞的凋亡敏感性进行筛选,不表达或弱表达BNIP3、NIX的肿瘤细胞能够耐受缺氧继续生长；高表达BNIP3、NIX的肿瘤细胞则发生凋亡,继而坏死。稳定的NIX表达可以减缓肿瘤细胞的生长速度。在缺氧条件下,NIX在各种细胞和组织类型中都有高水平表达,这表明NIX可能是在缺氧条件下存在的肿瘤抑制基因,NIX的表达与肿瘤细胞凋亡有关。

7 NIX与线粒体自噬的发生机制

最初,最简单的NIX依赖的线粒体自噬模型被认为是NIX触发线粒体的除极化,从而引起线粒体自噬和清除,这个模型已被大量的研究结果所证实[21]。另一项研究发现,体外培养超过16h的网织红细胞中,引起线粒体发生除极化的复合物,能够逆转因NIX缺失而引起的线粒体清除率降低[22]。但没有证据能解释,在网织红细胞中,NIX直接触发线粒体除极化这一过程。目前认为依赖于NIX的线粒体除极化时间发生在自噬体的形成与消除之间[23]。通过对具有自噬缺陷的网织红细胞中线粒体清除率的研究,可能会解决上述问题。

对于NIX触发线粒体除极化这一推论,面临的另一个问题在于它不依赖于Bax和Bak[24]。而值得注意的是,对于能够逆转NIX缺失的ABT-737是需要Bax或Bak来诱导线粒体除极化和细胞凋亡[22],这似乎与 NIX的机制不同。然而，NIX可能通过不依赖于Bax或Bak的其他通路导致线粒体除极化。尽管如此,这仅仅是推测,主要是因为线粒体清除的发生同样不依赖于MPTP[24],这种不依赖于Bax、Bak和MPTP的现象也说明了依赖于NIX的线粒体自噬不同于其他任何由BNIP3或NIX诱导的细胞凋亡机制。

第二种依赖于NIX的线粒体自噬模型假设NIX具有另一种独立的、不依赖于触发线粒体除极化的能力,称为恢复自噬元件。正如之前讨论过的,使BNIP3或NIX过度表达可在不同条件下诱导细胞自噬[14-17,25],这说明诱导细胞自噬可能是这些蛋白的本质特性。NIX缺失并非广泛地削弱红细胞的自噬能力,而是干扰针对线粒体的自噬体[22,24]。NIX可能作为线粒体自噬机制中的一个衔接蛋白和恢复元件而发挥作用,与这个推论相符,初步研究已证实NIX直接与微管相关蛋白LC3相互作用。

8 结论与展望

综上所述,虽然NIX拥有Bcl-2家族中的BH3-only亚群的一些共同特征,诸如在BH3结构域上的同源性,同样定位于线粒体外膜,亦能与Bcl-2和Bcl-XL相互作用,但其引起细胞凋亡的机制却与典型的BH3-only蛋白完全不同。NIX诱导细胞凋亡的能力较弱,通过引起线粒体内膜跨膜电位（△Ψm）降低,线粒体膜通透性孔开放,活性氧增加,引起细胞死亡。并且,NIX的羧基末端跨膜结构域并非BH3域,在诱导细胞凋亡过程中扮演了重要的角色。随后的研究证实了NIX诱导的非典型性细胞凋亡,而且同时它还诱导了细胞自噬。目前仍不清楚NIX诱导的细胞凋亡和细胞自噬的能力是两个相互关联,还是各自独立的功能。正如前文所述,NIX可能通过线粒体除极化导致细胞凋亡,同时因此而引起细胞自噬；又或者两者可能在发生机制上相互独立,却在功能上相互联系。除肿瘤以及心肌细胞以外,缺氧条件下NIX高表达是否在其他组织（如急性肺损伤等）有同样的诱导非典型细胞凋亡的能力,其促凋亡的具体机制及与在肿瘤、心肌基本方面的作用等一系列问题,还有待进一步研究。

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