Wnt信号通路与肾脏纤维化

周宝尚 综述,张 璟审校

(第三军医大学新桥医院肾内科/全军肾脏病中心/重庆市肾病研究所,重庆 400037)

肾小管间质纤维化是各种不同病因的慢性肾脏疾病进行性发展的共同通路,是导致终末期肾病的主要病理基础。近年研究显示,肾小管上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肾小管间质纤维化的重要机制之一[1],肾小管上皮细胞可通过EMT转分化为肌成纤维细胞(myofibroblast,MF),进入间质,合成细胞外基质(extracellularmatrix,ECM),直接导致肾间质纤维化的进行性发展。肾小管上皮转分化受多种因素影响,TGF-β1被公认为是最重要的诱导上皮细胞转分化的细胞因子。TGF-β1作为核心因子,启动并调节EMT的全过程,其诱导EMT的过程也是在病理状态下导致肾间质纤维化的主要途径[2]。除此之外,整合素连接激酶(intergrin-linked kinase,ILK),受体酪氨酸激酶-Ras/丝裂原活化的蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases,MAPK),RhoA/ROCK等均参与肾小管上皮细胞的转分化过程。Wnt信号转导通路在调控细胞的黏附、迁移、上皮间质转化、生长、分化、凋亡等过程,以及在胚胎发育、器官发生和维持组织器官内环境稳定中具有重要作用[3]。研究表明Wnt信号通路与肾纤维化的形成密切相关,近年来的研究证实Wnt信号转导通路在肾间质纤维化的发生发展中发挥着重要作用[4]。因此深入研究Wnt信号转导通路及其在肾间质纤维化发生发展中的作用,可为抗肾脏纤维化的治疗提供新的可能途径及干预靶点。

1 Wnt信号通路

1982年,Nusse和Varmus[5]在用小鼠乳头瘤病毒(mouse mammary tumor virus,MMTV)诱导小鼠乳腺癌过程中发现了Wnt基因,由于该基因的激活依赖MM TV的插入(insertion),因此被命名为Int21。随后的研究证明,Int21与果蝇属体节极性基因Wingless为同源基因,因此,又将Wingless与Int21结合,称为Wnt基因。

1.1 Wnt信号通路的组成 Wnt信号转导通路是一条在生物进化中极为保守的通路,调控着机体的许多生命过程。该通路的主要成分包括Wnt蛋白家族、Frizzled/低密度脂蛋白受体相关蛋白(Fz/LRP)、胞质内的 Dishevelled蛋白(Dsh)、β-环连蛋白(β-catenin)、糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、支架蛋白(axin/conductin)、结肠腺瘤性息肉病基因蛋白(adenomatous polyposis coli,APC)和 T细胞因子/淋巴增强因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor,TCF/LEF)转录因子家族。Wnt是一种富含半胱氨酸残基的分泌型糖蛋白,在进化过程中高度保守,在多种组织细胞中均有表达,主要通过自分泌或旁分泌的方式激活膜受体而发挥作用,Wnt蛋白表达是Wnt信号通路活化的重要起始信号。目前已知的主要有19种Wnt蛋白,参与 Wnt经典信号通路的Wnt蛋白有Wnt1,3a,8等。参与非经典信号通路的Wnt蛋白有Wnt4,5a,11等[6]。Fz为 7次跨膜蛋白,其氨基端的配体结合区(cysteine rich domain,CRD)富含半胱氨酸,是Wnt信号通路中最主要的受体蛋白。Dsh蛋白是Wnt经典信号从膜受体传递至胞内的中心分子,有3个高度保守的结构域(DIX、DEP、PDZ),Dsh能通过它的DIX结构域和PDZ与DEP结构域之间的一部分序列与axin相互作用。β-catenin是由CTNNB1基因编码的一种多功能蛋白质,具有介导细胞间黏附及信号转导两大功能,1980年由德国细胞生物学家Walt Birchmeier在研究细胞黏附分子E-钙黏蛋白(E-cadherin)相关分子时首先发现的,是Wnt信号通路中有转录调控活性的关键成员,在细胞核内与Wnt途径的另一成员TCF/LEF结合从而激活靶基因的转录[7]。

1.2 Wnt信号通路的转导过程 目前的研究证实Wnt信号转导通路分为:Wnt经典信号转导通路,也称 Wnt/β-catenin信号转导通路和Wnt非经典信号转导通路。Wnt/β-catenin信号转导通路是目前研究比较多、比较深入的一条分支。

当经典的Wnt信号转导通路被激活后,分泌到胞外的Wnt与跨膜受体Lrp5/Lrp6以及Fz结合形成复合物并激活受体,进而激活胞内的Dsh,导致GSK-3β活性受到抑制使其从axin上脱落,阻止β-catenin降解复合体(主要由 APC、axin、GSK-3β构成)的形成,因此β-catenin也就不会被磷酸化和降解[8]。研究同时发现β-catenin降解复合体(如 APC或 axin突变)和β-catenin基因本身突变均可导致β-catenin降解障碍。当胞内β-catenin达到一定的水平时,形成游离的β-catenin发生核转移,与转录因子TCF/LEF结合,形成转录激活复合体,最终实现某些特定基因表达的增强或者减弱。现有的研究证明[9]该信号通路可以激活 c2myc、周期素D1(cyclin2D1)、MMP-7、CD44、survivin、PPAR-γ、生长因子等,并且不断有新的靶基因被发现。在这条信号途径中β-catenin处于中心位置,其在细胞内的数量和状态对该途径有决定性影响,因此被认为是该信号途径激活的标志[10]。

Wnt非经典信号转导通路又分为Wnt/Ca2+通路和细胞极性通路(planar cell polarity pathway,PCP)。Wnt/Ca2+通路主要由Wnt5a和Wnt11激活,从而引起细胞内Ca2+浓度增加和Ca2+敏感信号成分的激活,以调节细胞黏着和细胞运动,但其具体的信号传导机制还不清楚。细胞极性通路PCP,其主要通过激活 Dsh下游区、小 GTP酶、Rho、Rac、Cdc等从而调节JNK信号来发挥作用[11]。该通路主要参与细胞极性的建立和细胞骨架重排。

2 Wnt信号通路与肾脏纤维化

2.1 Wnt信号通路相关蛋白在肾脏纤维化中的表达 正常机体肾脏中Wnt信号是“沉默”的[12],胞质中仅有少量游离态的β-catenin,体内绝大多数β-catenin在胞膜处与 E-cadherin形成复合体,对维持同型细胞的黏附、防止细胞的迁移发挥作用。Surendran等[3]利用单侧输尿管结扎方法造成大鼠小管间质性肾纤维化模型,发现Wnt4在集合管中有表达伴随集合管周围纤维化形成,间质成纤维细胞Wnt4高水平表达与I型胶原mRNA及α-SMA的高表达一致;体外实验表明Wnt4可以诱导培养的成纤维细胞β-catenin进入细胞核内。Surendran等进一步研究发现肾损伤后肾小管上皮细胞及间质细胞中βcatenin信号活化,重组的sFRP4蛋白可以抑制成纤维细胞的分化及其功能,从而抑制肾纤维化的进程。Bienz[10]在单侧输尿管结扎大鼠肾脏纤维化模型中发现多种Wnt信号通路及靶基因蛋白Wnt(1,2,2b,3,3a,4,5a,6,7a,7b,8a,9a,16)、FZD(3,10)、 DKK(1,3,4)、Twist、β-catenin、c-Myc、LEF、fibronectin、MMP-7均不同程度的升高。Lin等[13]研究表明在高糖条件下肾小球膜细胞 Wnt4、Wnt5a、p-GSK-3β、β-catenin 高表达。闫喆等[14]利用高糖培养的人肾小管上皮细胞,检测发现Wnt4、β-catenin和α-SMA的mRNA和蛋白表达水平均增高,而E-cadherin表达降低,且Wnt4及胞核β-catenin蛋白表达与高糖刺激呈时间依赖性。这些说明当肾脏纤维化时,Wnt信号转导通路相关蛋白表达增加,提示Wnt信号转导通路可能在肾脏纤维化中发挥重要作用。

2.2 Wnt信号通路在肾脏纤维化中的转导 当Wnt通路被激活后,Wnt蛋白与细胞膜上的跨膜受体结合,激活胞浆内的散乱蛋白,使β-catenin的降解复合体:Axin/APC/GSK-3β复合物解聚而失活,β-catenin磷酸化受抑制而降解减少,进入细胞核内的β-catenin大大增加,与转录因子 T细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)家族成员结合,形成转录激活复合体,引起特定的基因增强或减弱,最终促进EMT的发生,目前证实有Twist、E-cadherin、fibronectin、MM P-7、α-SMA 等重要的与纤维化相关基因[4,15]。同时,Wnt信号通路与 TGF-β1通路、PI3K/Akt通路和ILK之间有着重要的对话。TGF-β1促进Wnt蛋白的分泌,激活 PI3K/Akt通路和 ILK,直接磷酸化GSK-3β并抑制其活性,进而激活转录复合体β-catenin/TCF以及转录因子,促进 EMT[16]。此外,TGF-β1与受体结合,活化的TGF-β1受体能够特异地识别和磷酸化 Smad蛋白家庭成员Smad2和Smad3,R-Smads又与其伴侣分子Smad4结合,形成有功能的转录复合体,Smad3、Smad4可以与β-catenin和TCF/LEF结合,促进两信号间相互作用,引起靶基因的转录[17-18]。

3 以Wnt信号通路为靶点的抗纤维化治疗

越来越多的研究表明,Wnt/β-catenin信号转导通路与肾脏纤维化密切相关,因Wnt信号途径最早发现于肿瘤的发生,针对Wnt/β-catenin信号转导通路中信号分子为靶点的抑制剂已成为抗肿瘤的候选药物,而这些同样可能成为于抗肾脏纤维化的治疗靶点,只是目前仍在研究阶段。

3.1 在细胞外水平阻断Wnt信号 Wnt配体本身可通过反义寡核苷酸技术、RNA干扰技术及中和抗体技术等成为抗肾脏纤维化治疗靶点。Wnt信号分子的拮抗剂,如Wnt信号分子特异性结合的卷曲相关蛋白(frizzled-related proteins,FRPs)和DKKs,已成为天然的抗肿瘤药物。DKK蛋白是Wnt辅助受体LRP5/6的拮抗剂,具有抗肾脏纤维化潜能,在人类中已发现4种DKK蛋白。Zhu等[19]利用培养的间充质干细胞释放的DKK1可明显降低肿瘤细胞的侵袭和运动能力,并可诱导β-catenin的定位改变及增加细胞间黏附。Dai等[20]研究发现DKK1可以明显抑制阿霉素处理大鼠的Wnt/β-catenin信号转导通路,改善蛋白尿及肾脏纤维化。He等[4]研究发现DKK1可以显著的抑制单侧输尿管结扎大鼠肾脏β-catenin的堆积,从而抑制α-SMA以及胶原的产生。

3.2 在细胞质水平靶向 Wnt/β-catenin信号 Wnt/β-catenin信号转导通路通过细胞内蛋白-蛋白的相互作用而受到严密调控。由于结肠腺瘤性息肉病基因蛋白APC在结直肠癌中的核心作用,使针对该蛋白的β-catenin结合区域的阻断剂成为有效抑制肿瘤的物质。axin是Wnt/β-catenin信号转导通路的负性调控者,该基因突变是某些肿瘤发生的重要因素。刘树立等[21]将 axin基因转染入axin低表达的肺癌BE1细胞系,结果axin的mRNA和蛋白水平均明显增加,β-catenin蛋白表达明显减少,TCF-4的蛋白和mRNA表达均明显下降。同时,BE1-axin细胞的凋亡率增加,增殖和侵袭能力明显下降。因此,在胞质水平加强APC、axin等的表达,可以达到对过剩β-catenin的降解作用,从而阻断下游信号转导,达到抗纤维化的目的。

3.3 靶向β-catenin蛋白表达和降解 β-catenin是 Wnt信号通路的关键分子。以往研究表明,在纤维化的过程中都存在βcatenin表达水平上调,因此靶向β-catenin的治疗引起人们的广泛关注。目前,反义寡核苷酸技术、RNA干扰技术及蛋白敲除技术处于研究阶段。特异性的β-catenin干扰RNA可以减少肿瘤β-catenin蛋白的表达,从而阻断Wnt信号通路,成为不依赖GSK-3β磷酸化抗肿瘤治疗的一个新靶点。Hong等[22]用β-catenin干扰RNA转染人胃癌细胞,发现其可以显著抑制β-catenin的表达、胞核分布以及胃癌细胞的生长。麦玉洁等[23]同样用β-catenin干扰 RNA转染白血病细胞Jurkat和K562细胞,结果β-catenin的mRNA和蛋白水平均降低,对细胞的生长有明显的抑制。然而,目前其在抗肾脏纤维化方面的研究还有待进行进一步的研究。

3.4 在细胞核水平靶向 Wnt/β-catenin信号转导通路 βcatenin最终发挥生物学效应是在其入核同TCF/LEF形成复合物,增强或抑制特定的靶基因实现的。因此,抑制复合物的形成理所当然地成为了抗纤维化治疗的又一治疗靶点。Lepourcelet等[24]设计出用于鉴别抑制 TCF-4与β-catenin相互作用化合物的高通量药物筛选方法。Wei等[25]应用3种TCF-4与β-catenin复合物拮抗剂 PKF118-310、PKF115-584和 CGP 049090处理肝癌细胞,可以明显地抑制c-Myc、cyclin D1和survivin等的转录活性,从而抑制癌细胞的生长。

4 结 语

综上所述,Wnt信号转导通路在肾脏纤维化发生发展中起重要作用,但目前对Wnt信号转导通路本身及其在肾脏纤维化中的作用机制尚未完全阐明。Wnt信号转导通路的调控方式、与其他信号通路间的相互作用、各靶基因激活的作用和意义、参与Wnt信号转导通路的各分子的生理作用等均需进一步研究证实。随着对这条信号转导通路不断深入的了解,有望把Wnt信号转导通路作为抗肾脏纤维化治疗的一个重要靶点。

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