侧群细胞与卵巢癌干细胞*

赵 玲,邱 倩综述,杨 鹰△审校

(1.第三军医大学新桥医院妇产科,重庆 400037;2.河南开封市第155医院内二科 475000)

侧群细胞(side population,sP)是一类具有干细胞特性,能够排出活性污染Hoechst33342而具有弱荧光染色特性的细胞。利用这一特性,sP细胞可以通过免疫荧光激活细胞法结合流式细胞仪被分选,目前在人、鼠多种卵巢癌细胞株及患者腹水中成功分选、鉴定、培养,证实了sP细胞的存在,并证实其与肿瘤干细胞之间存在一致性。基于对sP细胞生物学特性的研究,进一步了解肿瘤干细胞在基因调控、信号转导等方面的研究,并且为研究卵巢癌干细胞创造有价值的细胞模型。本文就sP细胞在卵巢癌干细胞中的研究进展作一综述。

1 侧群细胞的发现

1996年Goodell等[1]在研究鼠造血干细胞(hemaopoies stem cells,HSCs)的过程中,用荧光染料 Hoechst33342染色小鼠骨髓细胞后,经流式细胞仪检测,在流式二维分析点阵图上发现一小群具有弱荧光染色或拒染特性的细胞,呈彗星状分布在细胞主群的一侧,他们将这群细胞称为侧群细胞(side population,sP),也称边群细胞。这类细胞约占骨髓细胞比例0.05%,虽然含量很低,但具有很强的造血干细胞活性,重建能力是普通骨髓的1000倍。目前,sP细胞已经成为一种常用的分离造血干/祖细胞的方法。甚至有学者认为sP细胞可作为鉴定干细胞的标志之一。继骨髓中分离出sP细胞之后,陆续在人和动物的许多正常组织中发现sP细胞的存在,如乳腺、心脏、肝脏、肺、脑组织、神经组织、小肠、气管、皮肤表皮组织、子宫内膜、子宫平滑肌、羊膜等中,发现sP细胞具有自我更新和多项分化潜能[2-7]。

随着人们对干细胞的深入了解及恶性肿瘤病因学的研究,发现肿瘤是一种干细胞疾病。肿瘤干细胞学说的提出[8],如何能成功分离和鉴定肿瘤干细胞就显得尤为重要,形态学上很难区分肿瘤细胞和肿瘤干细胞,只能在功能学上来鉴定肿瘤干细胞。目前肿瘤干细胞分离方法主要有3种:利用肿瘤干细胞的表面标志、无血清培养悬浮生长细胞球和sP细胞分选法。在仍不能完全确定某种特性类型肿瘤干细胞表面特异性膜蛋白标记,sP细胞分选法仍不失为分选肿瘤干细胞的一种常用方法。随着人们逐步开始研究sP细胞的生物学特性,在多种恶性肿瘤细胞株及肿瘤组织中检测sP细胞的存在,并证实其富含肿瘤干细胞样特性。最近的研究工作在淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌、甲状腺癌、喉癌、髓母细胞瘤、子宫内膜腺癌等[9-14]细胞系中检测出sP细胞的存在,并在人实体瘤肿瘤组织原代培养(如肝癌[15]、人神经母细胞瘤[16])中也检测有 sP细胞的存在,并初步研究sP细胞含量与肿瘤恶性程度的相关性。在对卵巢癌肿瘤干细胞的研究中,Szotek等[17]于2006年从鼠卵巢癌细胞系 MOCAR-7和 4306、人卵巢癌细胞系(IGROV-1,SKOV-3,OVCAR-3)和患者腹水细胞中检测出sP细胞,并培养研究其生物学特性。Hu等[18]在卵巢癌Ⅲ期患者腹水、卵巢癌细胞株(OVCAR3、A2780、A2780-CP,HEYA8、OCC1、SKOV3)异体移植免疫缺陷性小鼠培养后分选及鉴定出具有干细胞样特性的sP细胞。王伟等[19]在人卵巢癌细胞系OVCAR-3中检测sP亚群细胞具有很强的成瘤性和侵袭性,认为其具有一定的肿瘤干细胞样特性。虽然目前尚不能证明sP细胞亚群中百分之百的细胞都具有干细胞特性,同时并非所有肿瘤干细胞都具有sP细胞的特性,但其的确富集了具有引起并维持肿瘤发生发展能力的极少数干细胞样细胞。目前实验报道卵巢癌肿瘤干细胞的标记的说法不一,如CD44、CD117、CD24、CD133等,尚无特异的表面标记物,sP细胞分选法作为肿瘤干细胞分离纯化方法得到广泛应用,并得到肯定。用sP细胞来分选并富集卵巢癌肿瘤干细胞是可行的。因此具有sP细胞表型的干细胞将是研究卵巢癌肿瘤干细胞生物学特性的细胞模型,可以作为研究卵巢癌干细胞的重要资源。

2 卵巢癌sP细胞生物学特性的初步鉴定

2.1 sP的细胞表型 sP细胞膜表面高表达ATP结合盒转运子超家族,包括多药抵抗蛋白I(Mdela/1b,mouse;MDR1,human)和乳腺癌耐药蛋白1(breast cancer resistance protein1,Bcrp1)/ATP结合转运子G2(ATP-blinding cassette,subfamily G,member 2,ABCG2)。ABCG2是一种P-糖蛋白,属 ATP结合框转运体(A TP-binding cassette transponer,ABC)家族所介导的肿瘤细胞多重耐药分子家族中的一种,属跨膜药物转运蛋白,是抗肿瘤药物难以发挥效应的关键耐药蛋白,该蛋白质由多药抗性蛋白质1(multidrug resistance protein1,MDR1)基因和多药抗性相关蛋白(multidrugresistance associated protein,MAP)基因编码[20],这些转运蛋白可以被维拉帕米抑制,在实验研究中就发现sP细胞具有把染料Hoechst33342泵出细胞外的特性与ABCG2有关。在对卵巢癌细胞株A2780分选sP细胞实验中已证实[21],sP细胞中ABCG2分子的表达量明显高于Non-sP细胞,ABCG2+细胞对化疗药物的耐受能力则明显高于ABCG2-细胞,且ABCG2+细胞加人ABCG2单克隆抗体孵育后能使ABCG2-细胞对化疗药物的耐受性明显降低,说明ABCG2分子是参与维持卵巢癌细胞多药耐药性的一个主要分子标志。因此推测ABCG2分子可能是卵巢CSC表面的一个特异性分子标志,ABCG2/Bcrp1作为确定sP细胞的重要表型标记。研究者在采用sP细胞分选法来分离肿瘤干细胞时,流式细胞仪检测到sP细胞的存在后,加入维拉帕米后sP细胞比例减少,表明ABCG转运蛋白对维拉帕米敏感,其活性在维拉帕米存在的情况下有所减弱。并提出将荧光染料Hoechst33342外排、维拉帕米敏感、BCRP1+sP细胞有可能作为一种标记去用于检测和分离卵巢癌干细胞的一种生物学特性。

在Szotek等[17]通过流式细胞仪对人和鼠卵巢癌细胞系检测中发现MOVCAR-7中 sP细胞高密度表达 c-kit/CD117、CD44,但在细胞系4306和人腹水中不能表达,在MOVCAR-7和4306细胞系中 sP细胞和Non-sP细胞均不表达CD24、CD34、CD105、CD133、SCA-1。目前在卵巢癌细胞株中检测的表面标记物与肿瘤干细胞、sP细胞之间存在一定的相关性,仍不能证明所有的sP细胞都含有表面标志物,也不能证明sP细胞表面标记物的特异性。这就需要今后大量实验研究上有所进一步突破。

2.2 sP细胞的自我更新增值成瘤能力 sP细胞在肿瘤中的生物学特性可概括为具有自我更新、多向分化和高致瘤性,对放疗、化疗具抵抗性,与肿瘤干细胞生物学特性具相似之处。卵巢癌sP细胞可以通过对称和不对称细胞分裂的方式获得自我更新能力,在体外长时间克隆增殖。这一生物学特性与干细胞和肿瘤干细胞有类似的特性,为sP细胞具有肿瘤干细胞样特性提供依据。目前研究者在卵巢癌细胞株及患者腹水细胞中培养sP细胞,观察其生物学特性。Szotek等[17]在鼠卵巢癌细胞系MOVCAR7和4306、王伟等[19]均在人 OVCAR3细胞系中分选sP细胞并培养过程中证实sP细胞可发生不对称分裂增殖,sP细胞不仅可以产生sP细胞,还可以产生Non-sP细胞,而Non-sP细胞培养后不能产生sP细胞。并且在多次传代培养中发现sP细胞的比例不断升高,而Non-sP细胞体外增值受限。Patrawala等[22]在分析前列腺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌的肿瘤细胞株中证实,尽管sP细胞含量很少(0.01%～5%),但与Non-sP细胞相比,其具有高成瘤性。张弦等[23]在人卵巢癌细胞株A2780中,分选培养的sP细胞的平板克隆率及软琼脂克隆率均明显高于Non-sP细胞;裸鼠体内致瘤实验中,2周内sP细胞组有2只裸鼠长出了肿瘤(2/3),Non-sP细胞组在8周后仍无肿瘤生长(0/3)。Moserle等[24]也在人卵巢癌建立的细胞株中和异体移植后证实,sP细胞有较高的分芽、增殖、细胞凋亡率减少和高成瘤性。同一细胞株来源,且用相同细胞数量、同等时间内观察sP细胞的自我更新、克隆增殖、成瘤性等方面,sP细胞明显优于Non-sP细胞。这些生物学特性均为肿瘤干细胞的重要特征,因此可以证实卵巢癌sP细胞具有肿瘤干细胞最重要的特征。

3 侧群细胞与肿瘤干细胞之间的关系

近年来肿瘤干细胞的研究表明,多种恶性肿瘤的细胞系和肿瘤组织中都含有富含肿瘤干细胞样的亚群。在分离培养过程中,这些细胞具有自我更新、多分化潜能、高致瘤性、对放化疗的抵抗性等特性,与肿瘤干细胞生物学特性具相似之处。鉴于sP细胞的高致瘤性和增生潜能,人们广泛猜测sP细胞群体可能也包含肿瘤干细胞。分选后sP细胞群体更具克隆原性,与Non-sP细胞相比,在低细胞密度下优先存活。而且越来越多研究发现,肿瘤组织中存在具有干细胞特征的sP细胞,并将sP分选法可作为鉴定肿瘤干细胞的新方法。

sP细胞与肿瘤干细胞之间在生物学特征上存在一致性,但随着对sP细胞的不断研究,发现二者之间也存在一定的差异性。在人、鼠卵巢癌细胞株和人腹水细胞中分选的sP细胞时就发现,不是所有的卵巢癌细胞株中都能分选出sP细胞。而且在不同的细胞株中sP细胞的含量亦不尽相同,如Kondo等[25]报道,人乳腺癌细胞系MCF7和人宫颈癌细胞系Hela细胞中分别含有2.0%和 1.2%的sP细胞,而Parawala等[22]在MCF7中仅检测到约0.2%的sP细胞,在Hela细胞中未检测到sP细胞的存在。虽不能排除实验技术、条件、试剂等人为因素的影响,但也看到sP细胞与肿瘤干细胞之间存在差异性。随着研究进一步的深入,有观点提出不是所有的肿瘤干细胞都含sP细胞,sP细胞只是富集肿瘤干细胞样特性的一个亚群,其中部分细胞并非肿瘤干细胞;而且所有肿瘤干细胞都具有sP表型。各实验室用流式细胞仪分离获得sP细胞的数量和特性存在一定的差异,这就仍需大量反复实验研究,在工作中发现优化sP细胞分选条件,尽量减少一些人为或环境因素。sP细胞是否完全具有卵巢癌干细胞的功能特性有待今后的实验考证。

4 侧群细胞研究中存在的问题

鉴于sP细胞的分选主要是依靠外排荧光染料 Hoechst33342的特性。关于Hoechst33342染料是否具有细胞毒性说法不一。早在1982年Fried等[26]年就提出其是一种细胞DNA合成的抑制剂。随后实验发现Hoechst33342可明显抑制人乳腺癌细胞系MCF7和人卵巢癌细胞系SKOV-3中非sP细胞的克隆形成能力[27],并且sP细胞的克隆形成率也明显低于未经流式分选和未经Hoechst33342染料染色的细胞;分选出的sP细胞,与Non-sP细胞相比,具有更强的外排 Hoechst33342染料的能力,表明sP细胞所受 Hoechst33342染料带来潜在的毒副反应要小,对实验结果会产生一定的干扰。Szotek等[17]报道 Hoechst33342染料浓度的高低对 sP细胞不同周期含量的影响和对ABCG2/bcrp1蛋白的表达的差异。故sP细胞和Non-sP细胞成瘤能力的不同很可能是由 Hoechst33342的毒性作用造成的假象,而非真正的干细胞特性的差异引起的。是否存在sP细胞因具有膜转运能力而受到保护,而Non-sP细胞因得不到这种保护而被细胞毒性伤害,可能因此无法成瘤的这一观点,仍需通过今后大量的实验去证实。

通过近几年的实验研究结果表明,大多数肿瘤细胞系或异体移植肿瘤中sP细胞群体数目都较少,不能完全排除在一定程度上对检测可靠性的影响。不同实验室sP细胞群体“设门”各异,在很大程度上,从sP细胞群体中区分Non-sP细胞成分取决于人为因素且变化很大。而且sP细胞群体证实具有明显的异质性,肿瘤干细胞样细胞只是部分而非专一地富集于sP细胞群体。Patrawala等[22]在活体注射高数目的非sP肿瘤细胞时发现其也能导致肿瘤发生;高致瘤性的前列腺肿瘤细胞系PPC-1中sP细胞难以检测;另外,在低致瘤性的乳腺癌细胞系MCF7容易发现sP细胞,高致瘤性的M DA-M B231和MDAMB435却检测不到。可能由于不合理的培养条件或者缺少可定义的干细胞样群体,许多肿瘤还未能证实sP细胞的存在。

不同实验室采用sP细胞分选法研究同种类型肿瘤的肿瘤干细胞,在针对同一细胞株情况下,实验结果有时也存在较大偏差,缺乏很好的可比性。因此需要进一步摸索sP细胞的分离和纯化条件,建立合适的流式参数,确定Hoechst33342浓度和毒理曲线,只有这样才能更加科学地比较不同实验室分析的实验结果,去深入研究卵巢癌肿瘤干细胞与sP细胞之间的关系。

5 结 语

目前的实验研究已经证实sP细胞广泛分布于各种组织、器官及多种肿瘤组织和肿瘤细胞系中,而且具有明确的表型标记和分离方法,并富含干细胞样细胞。但通过对之前大量文献研究结果的回顾,该方法也有其自身的局限性;另一方面也不能不正视sP表型与肿瘤干细胞特异性分子表型之间的差异性。已有大量文献给出足够的证据证实二者之间具有一致性,但也另有一些实验结果证实二者之间存在差异性。

肿瘤干细胞表型标记了解有限,缺乏已知统一的特异性标记,因此肿瘤干细胞的分离纯化一直成为研究的难点。而sP细胞与相应组织来源的肿瘤干细胞有相似之处,具有干细胞样特性,因此sP细胞分选法仍不失为一种分离肿瘤干细胞有效的实验方法。目前在卵巢癌sP细胞的实验中仅局限在永生化的细胞株,有些报道从卵巢癌患者腹水中、卵巢癌组织中原代培养鉴定出sP细胞,但sP细胞的含量与肿瘤分化程度有无相关性的报道至今未见。而且在有些细胞株中并未检测出sP细胞,因此将sP细胞作为卵巢癌干细胞的一种特殊细胞亚群,还是作为卵巢癌干细胞的sP表型,是否是卵巢癌肿瘤复发和转移的根源,能否作为卵巢癌的筛选以及sP细胞的 ABCG2/Bcrpl耐药蛋白特性,还有待于今后大量实验证实。相信随着深入研究,sP细胞分选法不仅解决研究肿瘤干细胞中的干细胞来源问题,对推动肿瘤干细胞的研究和发展具有重要意义,也为肿瘤临床靶向性治疗提供新的思路和策略。

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