水迷宫评价蛋清高F值寡肽增强小鼠记忆功效的影响因素分析

林松毅，许海丽，孟秀娟，高丽霞，孙 鹏，刘静波

水迷宫评价蛋清高F值寡肽增强小鼠记忆功效的影响因素分析

林松毅，许海丽，孟秀娟，高丽霞，孙 鹏，刘静波*

(吉林大学军需科技学院营养与功能食品研究室，吉林 长春 130062)

以蛋清高F值寡肽为受试物，借助SMG-2水迷宫程序自动控制仪4个盲端评价方法，综合分析受试小鼠90d潜伏期变化情况，以考察蛋清高F值寡肽和SMG-2水迷宫4个盲端对小鼠潜伏期的影响。结果表明：给予蛋清高F值寡肽的小鼠在盲端Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区的潜伏期和对照组小鼠的潜伏期都表现出了显著性差异(P＜0.05)；通过对不同测试时间的潜伏期之间的显著性检验，表明受试小鼠的潜伏期在受试第60天时开始和之前的潜伏期有显著性差异。并且小鼠在盲端Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ区的潜伏期对训练时间的依赖性是逐渐增加的，既迷宫越复杂，小鼠对受试时间的依赖性越弱。SMG-2水迷宫程序自动控制仪评价蛋清高F值寡肽对小鼠的记忆时，选择盲端Ⅰ、Ⅱ区的潜伏期进行统计分析。

增强记忆；水迷宫；盲端；受试时间

高F值寡肽是一个由2～9个氨基酸残基所组成的混合小肽(或称寡肽)体系，F值(Fischer ratio)，是支链氨基酸(BCAA：Val、Ile、Leu)与芳香族氨基酸(AAA：Trp、Tyr、Phe)含量的物质的量比值[1]，高F值寡肽具有消除或减轻肝性脑病症状、改善肝功能和改善多种病人蛋白质营养失常状态及抗疲劳等功能[2]。近几年，国内高F值寡肽开发成为功能食品的研究热点[3]。许多有独特序列的肽还具有特殊的生理功能。肽对神经系统也有调节作用，是神经系统的重要活性物质，如脑啡肽、内啡肽等均含有典型的N末端序列：Tye-Gly-Gly-Phe，是一类具有激素和神经递质双重特性的生物活性物质，作用于中枢神经系统和外周器官[4]。一些低相对分子质量的活性寡肽已经成为当前食品科学界研究最为热门的课题之一[5]。用水迷宫测试方法研究干预因素对动物学习、记忆和空间定向及认知能力的影响，已经得到世界各国从事认知领域研究的科学家认可并推广和应用[6]。SMG-2水迷宫自动控制仪是测定小鼠立体空间学习记忆能力的常用仪器，但其设计有优点也有缺点[7]。

在课题组前期研究的基础上[7]和对水迷宫实验研究和应用的基础上[8-16]，本实验对给予蛋清高F值寡肽的小鼠在SMG-2水迷宫的4个盲端的潜伏期进行比较和研究，以研究蛋清高F值寡肽和SMG-2水迷宫4个盲端对受试小鼠潜伏期的影响。进而为后期的蛋清高F值寡肽改善记忆评价研究和小鼠改善记忆评价体系提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

雄性小白鼠，昆明种，清洁级，体质量(20±2)g，由吉林大学基础医学院提供；实验动物全价颗粒饲料：其生产许可证为SCXK-(吉)2003—2008，由长春市绿园区益生实验动物饲料厂生产，由吉林大学基础医学院动物实验中心监制。

蛋清高F值寡肽由吉林大学军需科技学院营养与功食品研究室提供，F值为47[6]；双蒸水由吉林大学军需科技学院营养与功能食品研究室提供。

SMG-2水迷宫程序自动控制仪 中国医学科学院药物研究所；灌胃针。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组

选取70只健康的昆明种雄性小白鼠经过3d实验条件的饲养后，按体质量随机分为7个实验组，每组动物数为10，受试90d，组间经t检验后无显著性差异。

表1 受试90d小鼠实验分组Table 1 The grouping of mice under intragastric administration for 90 d

1.2.2 小鼠水迷宫4个盲端潜伏期的测试

图1 水迷宫示意图Fig.1 Water maze diagram

连续给药90d，在灌胃30d后开始训练，训练期间继续给药，每天一次。

训练第1天用隔板将A点与B点的通道阻断，小鼠被置于台阶上10s，使其了解此安全区域的存在，然后将小鼠放于起点A，让其自由游泳，记录小鼠从盲端Ⅳ到爬上安全台阶的时间(即潜伏期)，如果在训练时间2min内尚未找到台阶者，将会被引导到安全台阶处，其潜伏期被记为2min。第1次训练后休息片刻按同样方法训练第2次。依次训练其他小鼠。

在训练的第2天，将隔板置于B点，小鼠的游泳起点为盲端Ⅲ，分别记录小鼠爬上安全台阶的潜伏期，每只小鼠连续训练2次。如果在2min找不到台阶者，将被引导到终点，其潜伏期被记为2min。在接下来的2d内，依次训练小鼠从盲端Ⅱ、Ⅰ开始到爬上安全台阶的潜伏期。以潜伏期为统计指标进行统计分析。

1.2.3 数据统计方法

实验数据采用Microsoft Excel软件及SPSS 13.0统计软件进行统计分析。用独立样本的t检验进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 水迷宫盲端Ⅰ区实验结果与分析

2.1.1 受试时间对盲端Ⅰ区潜伏期影响的差异性分析

图2 不同处理组和对照组在相同受试时间的盲端Ⅰ区潜伏期对比Fig.2 Comparison of incubation period of the blind-side 1 between treatment and control groups

如图2所示，在受试时间为80d时，TR3组小鼠的潜伏期和对照组有显著性差异(P＜0.05)，TR6组和对照组差异极显著(P＜0.01)。在受试90d时，TR1组小鼠的潜伏期和对照组差异极显著(P＜0.01)。

2.1.2 不同剂量受试物对盲端Ⅰ区潜伏期影响的差异性分析

如图3所示，在不同的受试时间内，对照组盲端Ⅰ区潜伏期无显著性差异，说明受试时间的延续和每周一次的测试没有对小鼠的盲端Ⅰ区潜伏期产生影响，排除了时间对盲端Ⅰ区潜伏期的影响。在受试70d时，对照组小鼠的潜伏期呈现了最低值，但是和其他时间的对照组的潜伏期相比无显著性差异，说明受试70d时，小鼠本身对水迷宫产生了良好的条件反应。在盲端Ⅰ区的潜伏期，TR3组小鼠不同测试时间的潜伏期表现出了更多的显著性差异。相反的是，TR6组小鼠在盲端Ⅰ区和对照组表现出了较少的显著性差异。

图3 相同组别在不同时间内的盲端Ⅰ区潜伏期对比Fig.3 Comparison of incubation period of the blind-side1 within the same groups

2.2 水迷宫盲端Ⅱ区实验结果与分析

2.2.1 受试时间对盲端Ⅱ区潜伏期影响的差异性分析

图4 不同处理组和对照组在相同受试时间的盲端Ⅱ区潜伏期对比Fig.4 Comparison of incubation period of the blind-side Ⅱ between treatment and control at the same testing time

如图4所示，在盲端Ⅱ区，各实验处理组和对照组没有显著性差异，只有在受试60d时，TR4组和对照组有显著性差异(P＜0.05)。但是，各实验组小鼠的盲端的潜伏期总体是下降的。

2.2.2 不同剂量受试物对盲端Ⅱ区潜伏期影响的差异性分析

如图5所示，对照组小鼠的潜伏期在第70天时和第30天及第40天的潜伏期表现出了显著性差异(P＜0.05)，同样地，对照组第80天的潜伏期和第30天及第40天的潜伏期有显著性差异(P＜0.05)；对照组第90天的潜伏期和第30天及第40天的潜伏期也表现出了显著性差异，且第90天的潜伏期和第80天的潜伏期也有显著性差异(P＜ 0.05)。说明在第70天时，时间的积累对小鼠盲端Ⅱ的潜伏期具有了显著性的影响，既在第70天后，由于每隔一定时间对小鼠的水迷宫测试使小鼠本身对水迷宫产生了良好的条件反射。从对照组所对应的柱形图还可以看出，小鼠盲端Ⅱ区的潜伏期是随着时间的延续而不断减少的，这也可以得出时间对小鼠的盲端Ⅱ区潜伏期的影响是很大的，至第70天时开始表现出显著性差异。此外，CTR组潜伏期对受试时间的直线方程为y=-0.4147x＋51.785，相关系数R为0.9756，说明受试时间越长，时间因素对潜伏期的影响将变得越来越大。并且除了TR6组外，各蛋清寡肽处理组小鼠的盲端Ⅱ区的潜伏期表现出了更多的显著性差异。大多数处理组在受试第60天时开始表现出了显著性差异。

图5 相同组别在不同时间内的盲端Ⅱ区潜伏期对比Fig.5 Comparison of incubation period of the blind-sideⅡ within the same groups at the different time

2.3 水迷宫盲端Ⅲ区实验结果与分析

2.3.1 受试时间对盲端Ⅲ区潜伏期影响的差异性分析

图6 不同处理组和对照组在相同受试时间的盲端Ⅲ区潜伏期对比Fig.6 Comparison of incubation period of the blind-side Ⅲ between treatment and control at the same time

如图6所示，在小鼠受试30d和40d时，TR4组小鼠在盲端Ⅲ区的潜伏期和对照组相比表现出了极显著性差异(P＜0.01)。

2.3.2 不同剂量受试物对盲端Ⅲ区潜伏期影响的差异性分析

如图7所示，CTR组小鼠盲端Ⅲ的潜伏期，第60、80、90天的潜伏期和第30天及第40天的潜伏期差异显著(P＜0.05)，CTR组潜伏期对受试时间的直线方程为y=-0.2388x+27.203，相关系数R为0.9492，同盲端Ⅱ区，时间的积累对游程最短的盲端Ⅲ区产生了很大的影响。

图7 相同组别在不同时间内的盲端Ⅲ区潜伏期对比Fig.7 Comparison of incubation period of the blind-sideⅢwithin the same groups

2.4 水迷宫盲端Ⅳ区实验结果与分析

2.4.1 受试时间对盲端Ⅳ区潜伏期影响的差异性分析

图8 不同处理组和对照组在相同受试时间的盲端Ⅳ区潜伏期对比Fig.8 Comparison of incubation period of the blind-sideⅣbetween treatment and control group at the same time

如图8所示，在各不同的测试时间里，实验处理组小鼠的潜伏期和对照组没有表现出显著性差异。但是各实验组小鼠的潜伏期随着时间延长是逐渐下降的。

2.4.2 不同剂量受试物对水迷宫盲端Ⅳ区潜伏期影响的差异性分析

图9 相同组别在不同时间内的盲端Ⅳ区潜伏期对比Fig.9 Comparison of incubation period of the blind-sideⅣwithin the same groups

如图9所示，对照组小鼠盲端Ⅳ区潜伏期和时间的线性相关系数为0.9501，除了TR5组小鼠以外，其他各组小鼠在盲端Ⅳ区的潜伏期在受试第70天时和第30天的潜伏期有显著性差异。

因此，不同剂量的蛋清高F值寡肽能在不同程度上缩短小鼠的潜伏期，也说明了水迷宫的游程越长，实验处理组和对照组越易于表现出显著性差异；游程越短，处理组和对照组之间的差异越难表现出来。所有实验处理组和对照组的盲端Ⅰ区的潜伏期在第60天时只是出现稍微的下降，而各实验处理组和对照组的盲端Ⅱ～Ⅳ的潜伏期在第60天时则呈现了明显的下降的趋势，说明了水迷宫的游程越短，时间对潜伏期的影响越显著。也就是说，迷宫的路程越复杂，小鼠的潜伏期对时间的依赖性越弱。

3 结 论

与灌胃双蒸水的对照组相比，受试蛋清寡肽小鼠的潜伏期在受试第60天时和对照组开始表现出了显著性差异。说明小鼠在受试第60天时蛋清高F值对小鼠的潜伏期有显著影响，能缩短小鼠在水迷宫中的潜伏期。对小鼠的记忆具有一定的改善作用。

各盲端的CTR组小鼠和时间的线性方程的R值都超过了0.9，说明时间的积累对潜伏期的影响将变得越来越大。

通过对小鼠在不同盲端潜伏期之间的比较，发现水迷宫的游程越短，时间对潜伏期的影响越显著；迷宫的路程越复杂，小鼠的潜伏期对受试时间的依赖性越弱。所以在用SMG-2通道式水迷宫进行动物实验时，应选择盲端Ⅰ、Ⅱ区的潜伏期进行统计分析，以减少时间因素对实验结果的影响。

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Analysis of Influence Factors of Memory Enhancement in Mice Administrated with High F Value Oligopeptide in Water Maze

LIN Song-yi，XU Hai-li，MENG Xiu-juan，GAO Li-xia，SUN Peng，LIU Jing-bo*
(Laboratory of Nutrition and Functional Food, College of Quartermaster Technology, Jilin University, Changchun 130062, China)

The objective of this study was to observe the effect of egg white oligopeptide and the four blind sides on memory enhancing in mice. Based on SMG-2 water maze, the length of incubation period in blind-sideⅠ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ in water maze of mice administered intragastrically with high F value oligopeptide from egg white were measured. The results showed that the mice treated with high F value oligopeptide showed significant differences from the control group. Significance test of differences among latent times after a certain time of administration indicated that latent times in mice after 60 days of administration significantly differed from those after fewer days (30, 40 and 50). And mice in blind-side Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ area had a timedependent incubation period upon training, implying that the more complex the maze was, the more intense time-dependent was. While evaluating the memory enhancing ability of egg white oligopeptide, it is better to analyze the incubation period of mice in blind-sideⅠand Ⅱ.

memory enhancement；water maze；blind-side；test time

TS201

A

1002-6630(2011)03-0191-04

2010-05-08

国家“863”计划项目(2007AA10Z329)

林松毅(1970—)，女，副教授，博士，主要从事功能食品研究与开发。E-mail：linsongyi730@163.com

*通信作者：刘静波(1962—)，女，教授，博士，主要从事营养与功能食品研究。E-mail：ljb168@sohu.com