球茎甘蓝小孢子培养胚诱导和植株再生研究

王超楠，闻凤英，刘晓晖，罗智敏，赵冰，黄志银

（天津科润蔬菜研究所，天津，300384）

球茎甘蓝小孢子培养胚诱导和植株再生研究

王超楠，闻凤英，刘晓晖，罗智敏，赵冰，黄志银

（天津科润蔬菜研究所，天津，300384）

以10个球茎甘蓝品种（系）为试材，采用游离小孢子培养方法，研究胚状体发生及其再生植株获得方法。研究结果表明，添加适量6-BA不仅使胚诱导成功率达到了100%，还显著提高了出胚率；胚状体发育程度和整齐度与基因型及每皿出胚数有关；子叶期为最佳的转接时期；MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L NAA是最适的成苗培养基。

球茎甘蓝；小孢子培养；胚状体；植株再生

球茎甘蓝 （Brassica oleraceaL.var.caulorapaDC.）又名苤蓝，营养丰富，是制作腌菜的重要原料，近年来鲜食用量呈上升趋势。但目前国内主要栽培种为常规种，种性退化严重，无法与国外的优质品种竞争，所以选育具有自主知识产权的球茎甘蓝杂交新品种是亟待解决的问题。利用游离小孢子培养技术进行亲本纯化，可以快速获得亲本材料，缩短新品种选育年限。自Lichter[1]首次报道获得甘蓝型油菜小孢子胚及再生植株以来，很多学者对十字花科蔬菜小孢子培养过程中的影响因素进行了研究[2～4]，但迄今为止，国内还未见球茎甘蓝小孢子培养植株再生的相关报道，试验以10个球茎甘蓝品种（系）为试材，对影响胚诱导和植株再生的因素进行系统研究，并获得了大量胚状体和再生植株。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为10个球茎甘蓝品种（系）：川岛脆、河东大苤蓝、东川苤蓝、天津青苤蓝、大青皮芋头、玉冠、早冠、天津白苤蓝、H和P3。2008年8月中旬播种于穴盘育苗，9月初定植到冷棚中，11月下旬移入阳畦越冬，2009年1月中旬移栽至温室，花期取材培养。

1.2 试验方法

花期选取长2.5～4.5 mm的花蕾分离小孢子，分离纯化和悬浮培养过程参照栗根义等[5]和姜凤英等[6]采用的方法，稍有改良。

①分别在A：1/2 NLN-13；B：1/2 NLN-13+0.2 mg/L 6-BA；C：1/2 NLN-13+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 3种培养基上对10个试材进行培养，分析植物生长调节剂对胚诱导的影响。

②以川岛脆、H、P3、天津白苤蓝为试材，在其他培养条件相同的情况下，分析基因型对胚状体发育的影响。

③以川岛脆、P3为试材，在其他培养条件相同的情况下，分析每皿胚数对胚状体发育的影响。

④以H各发育时期的胚状体为试材，分别接种于MS＋3%蔗糖＋0.8%琼脂培养基上，置于25℃，光照12 h/d，光强6 000 lx的培养室中培养。分析胚状体发育状态对胚成活的影响。

⑤以H的子叶形胚为试材，接种于添加不同浓度6-BA和NAA的MS＋3%蔗糖＋0.8%琼脂培养基上，6-BA设 0.2，0.5，1 mg/L 3个浓度，NAA设0.05，0.1 mg/L 2个浓度，空白处理为对照，总共6个处理，分析植物生长调节剂对胚成活及萌芽的影响。

成活率（%）=（成活胚数/接种胚数）×100%

不定芽诱导率 （%）=（萌发不定芽胚数/成活胚数）×100%

2 结果与分析

2.1 植物生长调节剂对小孢子胚诱导的影响

由表1可知，在1/2 NLN-13基本培养基上，10个基因型中有5个诱导得到胚状体，诱导成功率为50%，添加0.2 mg/L 6-BA后10个基因型均诱导出胚，诱导成功率达到100%，且出胚率显著提高，但再加入NAA后，几乎所有品种出胚率都显著下降，说明6-BA对胚诱导有明显的促进作用，而NAA多数情况下为抑制作用。川岛脆苤蓝出胚率不加植物生长调节剂时最高，添加植物生长调节剂后反而大幅降低，说明植物生长调节剂在诱导中起到了重要的作用，能够扩大基因型反应范围，但不同基因型的反应不同。

表1 植物生长调节剂对球茎甘蓝小孢子胚诱导的影响

表2 基因型对球茎甘蓝小孢子胚发育的影响

表3 每皿胚数对球茎甘蓝小孢子胚发育的影响

表4 胚状体发育时期对胚成活的影响

2.2 基因型对胚状体发育的影响

本试验中获得的胚状体有的能够发育成子叶形，有的则停留在鱼雷形、心形甚至球形不再发育，而且胚状体发育具有不同步性，往往同一皿中会出现几种发育阶段胚状体并存的情况。从表2可以看出，川岛脆的胚状体发育程度最高，整齐度也一致，子叶形胚比例达到了68.9%，显著高于H，P3和天津白苤蓝。天津白苤蓝的发育程度最差，只有3.33%的子叶形胚，大多数为处于发育初级阶段的球形胚和心形胚，说明基因型是影响胚状体发育的重要因素，不同基因型诱导得到的胚状体发育程度和整齐度存在显著差异。

2.3 每皿胚数对胚状体发育的影响

观察发现胚状体发育程度和整齐度还与每皿胚数有关。从表3可知，当川岛脆每皿胚数低于60个时，子叶形胚比例可达80%；而当每皿胚数高于100个时，子叶形胚比例明显下降，只有24.44%。同样当每皿胚数高于100个时，P3的子叶形胚比例也明显下降，由34.44%下降到了8.89%。说明除了基因型的影响外每皿胚数也对胚状体发育有很大的影响，每皿中胚数量过多不利于胚状体的发育。

2.4 胚状体发育时期对胚成活的影响

由表4可以看出，胚成活率与胚状体发育时期关系密切，发育成熟的胚状体成活率远高于发育不完全的胚。子叶形胚成活率为83.33%；鱼雷形胚成活率为 43.33%；心形胚和球形胚成活率仅为18.89%；畸形胚不再继续发育，成活率为0。可见胚状体成熟度较高时，转移到再生培养基上较容易成活，所以子叶形胚为转接的最佳时期。这与姜凤英等[7]在羽衣甘蓝上的结论一致。

2.5 植物生长调节剂对胚成活及萌芽的影响

培养基中添加不同浓度配比的植物生长调节剂，对胚状体成活和不定芽诱导都有影响。表5显示，添加0.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA时胚状体成活率最高，达到86.67%，此时的不定芽诱导率也最高，为42.31%；其次是0.5 mg/L 6-BA＋0.05 mg/L NAA的组合；不添加植物生长调节剂时虽然也能获得较高的胚状体成活率，但是不能诱导分化出不定芽，不利于进一步成苗；植物生长调节剂浓度过高时又会导致胚状体成活率和不定芽诱导率下降。所以添加适宜浓度配比的植物生长调节剂，既有利于提高胚状体成活率，又能诱导产生不定芽。

2.6 再生植株的获得

将诱导得到的不定芽经过几次继代后得到健壮试管苗，在MS+0.1 mg/L NAA的生根培养基上进行生根，2周后就能长出根系形成完整植株。经炼苗后，将带有根系的试管苗移栽至营养钵中，前期覆盖塑料薄膜保湿，2周后即可成活。

表5 植物生长调节剂对球茎甘蓝小孢子胚成活及萌芽的影响

3 小结与讨论

冯辉等[8]报道，在菜用羽衣甘蓝游离小孢子培养中，适宜浓度的6-BA与NAA配合使用显著提高了胚状体诱导率。在本试验条件下发现，添加一定浓度的6-BA不但能够扩大球茎甘蓝的出胚基因型范围，使成功率由50%提高到100%，还显著提高了出胚率，特别是对在未添加植物生长调节剂时不能出胚或出胚率较低的基因型作用更明显。但在同时添加6-BA和NAA时，胚诱导率却比单独添加6-BA时有所下降，与前人的结论不同，可能是由于选用的试材不同造成的，也可能是因为本试验中所设浓度处理较少，所以要获得每种基因型的最适浓度配比，需要设计多处理试验。

本试验表明，基因型和每皿出胚数都对胚状体发育有显著的影响。每皿出胚数较少时，胚状体发育整齐度和成熟度都较高，随着出胚数的增加，球形胚和心形胚比例升高，子叶形胚比例明显下降。这可能是由于当每皿中胚状体数量过多时，造成营养不足，导致胚状体发育受到影响。此外试验中观察到，当发现出胚较多时及时向培养皿中添加新鲜培养基或先将较大的胚转出均有助于胚状体的进一步发育。

在MS培养基中添加0.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA有利于提高胚状体成活率和不定芽诱导率，尽早诱导产生不定芽可以减少继代次数，加快成苗速度，而且分化出的大量不定芽还有利于再生植株的扩繁。

[1]Lichter R.Induction of haploid plants from isolated pollen ofBrassica napus.[J].Z.pflanzenphysiol,1982,105:427-434.

[2]Sato T,Noshio T,Hirai M.Plant regeneration from isolated microspore culture of Chinese cabbage(Brassica campestris ssp．pekinensis)[J]．Plant Cell Reports,1989,8:486-488.

[3]方淑桂，陆文辉，曾小玲，等．结球甘蓝游离小孢子培养及植株再生[J]．园艺学报，2006，31（1）：158-160.

[4]耿建峰，侯喜林，张晓伟，等．影响白菜游离小孢子培养关键因素分析[J]．园艺学报，2007，34（1）：111-116．

[5]栗根义，高睦枪，赵秀山.大白菜游离小孢子培养[J]．园艺学报，1993，20（2）：167-170.

[6]姜凤英，冯辉，王超楠.羽衣甘蓝的小孢子胚诱导和植株再生[J]．植物生理学通讯，2005，41（6）：725-727.

[7]姜凤英，冯辉，王超楠，等.几种影响羽衣甘蓝小孢子胚状体成苗的因素[J].植物生理学通讯，2006，42（1）：58-60.

[8]冯辉，郭姝，冯建云，等.菜用羽衣甘蓝的小孢子胚诱导和植株再生[J].园艺学报，2009，36（4）：587-592

Research on Embryogenesis and Plant Regeneration from Isolated Microspore Culture of Kohlrabi

WANG Chaonan,WEN Fengying,LIU Xiaohui,LUO Zhimin,ZHAO Bing,HUANG Zhiyin
(Tianjin Kernel Vegetable Research Institute,Tianjin 300384)

Isolated microspore culture was carried out by ten cultivar(strains)of Kohlrabi.It was found that adding suitable concentration of 6-BA could not only raise the embryo induction success to 100%,but also improve inducing rate remarkably.Genotypes and the number of embryos per dish had some effect on development of embryos.Cotyledon period is the optimal stage to transfer to plantlet regeneration medium."MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L NAA"was the optimal plantlet regeneration medium.

Kohlrabi;Microspore culture;Embryo;Plant regeneration

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.02.004

天津市科技支撑计划重点项目（08ZCKFNC01900），天津市自然科学基金项目（10JCYBJC08700），天津市农科院院长基金项目（08008）

王超楠，女，硕士，助理研究员，主要从事十字花科蔬菜育种，E-mail：chaonan229@163.com

2010-08-13