番石榴叶抗II型糖尿病活性成分的虚拟筛选*

刘美凤蒋利荣刘华鼐林静群

(1.华南理工大学化学与化工学院，广东广州510640;2.广东省绿色化学产品技术重点实验室，广东广州510640)

II型糖尿病占糖尿病发病群体的90%，其发生的主要机制为胰岛素抵抗，在分子水平上表现为胰岛素与受体结合后信号向细胞内转导障碍.蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)在胰岛素上游信号转导链中起负向调节作用［1］，可使蛋白酪氨酸去磷酸化，从而阻断胰岛素与受体结合过程的信号转导［2］，导致胰岛素抵抗，致使血糖升高.过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是脂肪合成、能量稳定、糖脂代谢平衡的关键调控因子，激活过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)可增强胰岛素与其受体结合的信号传导，提高胰岛素的敏感性，从而有效降低血糖.此外，PPARγ还可减弱肿瘤坏死因子α和瘦素诱导的胰岛素抵抗［3］.PTP1B和PPARγ已成为治疗II型糖尿病新颖的靶标.另外，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制剂可减少葡萄糖的产生和摄取，降低餐后血糖.因此，筛选和寻找安全有效的α-淀粉酶或葡萄糖苷酶抑制剂是药学家的关注热点.

番石榴叶为桃金娘科植物番石榴Psidium guajavaL.的干燥叶及带叶嫩茎，其提取物具有抗氧化、清除自由基、保护心脏［4］、降血糖和降血压［5］等多种药理活性.对其的化学研究主要围绕着抗微生物和治疗急性腹泻及痉挛活性，分离得到黄酮和三萜类化合物［6-10］，但番石榴叶治疗II型糖尿病的活性成分及其机理尚不清楚.Discovery Studio2.1软件中的CDOCKER模块是基于CHARMm的半柔性对接程序，采用Softcore Potentials以及Optional grid representation将配体分子与受体活性位点进行对接.文中在化学成分研究的基础上，借助Discovery Studio 2.1软件的CDOCKER模块，以番石榴叶中分离得到的和已知的三萜皂苷类、黄酮类和鞣质类化合物为配体，分别与PTP1B、PPARγ、α-淀粉酶以及α-葡萄糖苷酶进行分子对接，根据其对接位点数和对接亲和能的大小进行打分，分析番石榴叶治疗II型糖尿病的活性成分，为进一步的理性设计提供依据.

1 材料与方法

1.1 酶/受体结构信息来源及处理

从Brookhaven蛋白质数据库(http:∥www.rcsb.org/pdb/home/home.do)下载所用到的PTP1B、PPARγ、α-淀粉酶以及α-葡萄糖苷酶的三维结构模型.使用Discovery Studio软件中的Protein Reports and Utilities Tools除去单晶衍射图中的水分子、金属离子、乙酸分子，只保留这4个蛋白分子与原始配体，优化氢键值设为Sample Water Orientations，最后得到可用于对接的PTP1B、PPARγ、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的三维立体结构.

1.2 配体小分子化合物库的准备

番石榴叶中分离得到和已知的共32个化合物为配体小分子化合物库，主要含有三萜皂苷、黄酮以及鞣质类化合物［11］，见表1.首先利用Discovery Studio软件的绘图功能，绘制出化合物的立体结构，接着对其进行加氢、加电荷，最后对小分子的构象进行能量优化处理.

表1 番石榴叶中的化合物Table 1 Compounds in Psidium guajava leaf

续表1

1.3 配体与酶/受体的分子对接

利用Discovery Studio 2.1软件的CDOCKER模块进行分子对接，当对接完成后，可以在Out put的文件夹里看到对接的结果.分子对接的结果以对接能作为对接分值的打分指标，对接能的负绝对值越大，证明受体与底物的对接亲和力越大，同时也预测小分子与受体结合的活性越高.

2 结果与讨论

2.1 与PTP1B的作用

表2 番石榴叶中小分子化合物与PTP1B的对接结果Table 2 Docking results of PTP1B with small molecules compounds in Psidium guajava leaf

与PTP1B进行分子对接的结果见表2.三萜皂苷类化合物没有对接位点，而黄酮类化合物中，山奈酚的亲和活性最强，其分子对接效果见图1(a).可见2-苯基色原酮为母核的黄酮类化合物，若C-2位连接的苯环与母核不在同一平面时，将大大降低PTP1B和化合物的亲和能力，空间结构或许是其中主要的影响因素;而连接上糖苷的黄酮类化合物无对接位点.PTP1B与咖啡酸、没食子酸、原儿茶酸和阿魏酸的对接能量低，对接活性较高，可能与其结构简单、空间位阻小，且其酚羟基的间位都接有羧基或者丙烯酸结构有关.PTP1B与咖啡酸的对接效果见图1(b).

图1 PTP1B与山奈酚分子和咖啡酸分子的对接效果Fig.1 Molecule modeling of PTP1B docked with kaempferol and caffic acid

2.2 与PPARγ的作用

表3 番石榴叶中小分子化合物与PPARγ对接结果Table 3 Docking results of PPARγreceptor with small molecules compounds in Psidium Guajava leaf

图2 PPARγ与α-谷甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、没食子酸的分子对接效果Fig.2 Moleculemodeling of PPARγdocked withα-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside，querecetin and gallic acid

与PPARγ进行分子对接时，3类化合物均有对接位点(见表3)，对接效果最好的为α-谷甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，槲皮素和没食子酸(见图2).其中，α-谷甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对接位点比β-谷甾醇多，但后者与受体的亲和力却要强得多，可能与β-谷甾醇的构型以及其糖基化后空间结构变化有关.三环共平面的化合物与PPARγ的亲和力更好.鞣质类化合物的酸性以及其空间的平面结构对其对接结果有直接的影响.

2.3 与α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的作用

分别用α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶与配体库内化合物依次进行分子对接，自动搜索后对接位点数为0.这可能是由于α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的结合空腔过于狭窄，而Discovery Studio软件比较适合球形空腔的分子对接，因此在自动搜索时出现没有任何对接位点的情况.

2.4 讨论

文中通过分子模拟和对接评分的方法，筛选出番石榴叶中能与PTP1B、PPARγ对接的化合物，其中黄酮和鞣质类化合物与PTP1B和PPARγ的结合活性较高，尤其是山奈酚、没食子酸、Guavin B、α-谷甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷这4个小分子化合物.

与PTP1B对接时，若底物含有苯环，则对接分值比较理想，但连接上糖苷后，会降低对接的可能性.若底物含有无取代苯环基团的小分子化合物，则其对接分值较差.含有直链烷烃型的小分子对接分值理想，但(CH2)n中n＞3，则对接分值不理想;当受体为PPARγ，四环三萜类的对接分值比五环三萜类理想，而且在C-2位连接上糖苷键后有较大的提高.当底物为酚类时，含有糖苷键的小分子化合物比直链烷烃型的对接分值理想，且其烷烃链越长，对接分值越理想.

番石榴叶中黄酮类以及鞣质类化合物与蛋白质受体的活性部位间的作用并没有结合水分子的参与，二者通过疏水作用和氢键作用相互结合.因此，可以对活性较高的黄酮类、鞣质类小分子进行立体结构改造，引入有疏水作用的基团，提高其与PTP1B酶和PPARγ对接的亲和活性，进一步提高其抗糖尿病活性.

3 结语

文中采用虚拟筛选的方法所得结果，一定程度上佐证了Oh等［12］给出的番石榴叶提取物通过抑制PTP1B活性而降低Leprdb/Leprdb小鼠血糖的结论.尽管虚拟筛选有可能存在假阳性结果，与动物实验和体外实验结果可能会有一定偏差，但分子模拟这种方法针对性强，是一种较好的药物筛选手段，尤其可为后期基于药物靶标的活性成分研究和结构修饰提供重要的指导和借鉴.

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