重要深部真菌病研究进展

廖万清，潘搏，潘炜华

上海长征医院皮肤病与真菌病研究所/上海市医学真菌分子生物学重点实验室/全军真菌与真菌病重点实验室/第二军医大学附属长征医院皮肤科，上海 200003

真菌广泛分布于自然界，约有150万种，其中绝大多数种群对人类直接或间接有利，但有400余种可引起人类疾病。真菌病是由病原真菌引起的人类感染性疾病。真菌感染外可累及皮肤、毛发和指(趾)甲，内可在多脏器播散，免疫抑制患者和无基础疾病的宿主均可成为真菌宿主。按感染部位可将真菌病分为浅部真菌病和深部真菌病。浅部真菌病可累及表皮、毛发和指(趾)甲，深部真菌病指致病性真菌侵犯皮下组织、黏膜和内脏器官所引起的真菌感染性疾病。近年来，随着免疫抑制剂、皮质类固醇激素和广谱抗生素在临床的广泛应用，以及恶性肿瘤、艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)患者的增加，深部真菌感染发病率急剧上升。深部真菌病有病情进展快、诊断难、疗效差、治疗费用高等特点。但目前对病原真菌的研究远不及细菌、病毒深入，尚需广大科研和临床工作者对医学真菌进一步研究。本文仅就重要深部真菌病的流行病学、真菌与宿主间的相互作用及真菌病的诊治作一述评。

1 重要深部真菌病的流行病学

近20年来深部真菌感染呈上升趋势，已成为威胁人类健康的重要感染性疾病之一。最常引起深部真菌病的真菌包括假丝酵母(又称念珠菌)、隐球菌和曲霉。此外，接合菌纲、暗色真菌、镰刀菌属的某些菌种也可造成深部真菌感染[1]。

侵袭性真菌病中最常见的致病真菌为假丝酵母属。1995～2002年美国49所医院连续7年监测资料表明，假丝酵母败血症在医院感染败血症中居第4位，病死率则居首位[2]。目前，引起深部感染的假丝酵母主要包括白假丝酵母、光滑假丝酵母、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母和克柔假丝酵母，其中白假丝酵母虽占首位，但所占比例逐年下降，非白假丝酵母引起的深部假丝酵母病正逐年上升[3]。

侵袭性曲霉病患者的发病率仅次于假丝酵母败血症。引起该病的曲霉主要包括烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉[4]。骨髓移植、血液恶性肿瘤、实体器官移植、AIDS和肺部基础疾病患者为该病的易感人群。由于此类患者往往存在基础疾病，一旦合并曲霉感染，预后严重，抗真菌治疗失败率为36%，仅用两性霉素B治疗时病死率高达65%[5]。

隐球菌病主要是由新生隐球菌及格特隐球菌引起的一种深部真菌病，在临床并不少见。该菌可从鸽粪、土壤及桉树中分离到。隐球菌病可侵犯皮肤和内脏器官。美国疾病预防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)调查显示，全球每年因AIDS而新发的隐球菌病病例约1 000 000例，每年约625 000例AIDS患者因该病而死亡。在撒哈拉以南非洲感染性疾病死亡原因中，该病排行第4位[6]。

目前导致人类疾病的隐球菌主要有新生隐球菌和格特隐球菌。其中，格特隐球菌最近从新生隐球菌格特变种水平上升至种的水平，称格特隐球菌[7]。该菌是造成加拿大温哥华岛隐球菌病流行的主要元凶。以往认为隐球菌为条件致病菌，只在人体免疫功能低下时才引起人类感染。然而最新研究显示，该病亦可感染人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)阴性且免疫功能正常的人群，而且与HIV感染或免疫抑制患者相比，这类患者预后往往更差[8]。加拿大暴发的格特隐球菌病累及的也大部分是免疫力正常人群[9]。对从上述北美隐球菌病流行区临床、环境中分离的隐球菌进行多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)，共分离出4种不同基因型格特隐球菌，即VGⅠ、VGⅡ、VGⅢ和VGⅣ，其中VGⅡ型又可分为VGⅡa、VGⅡb和VGⅡc 3种不同亚型。VGⅡa型格特隐球菌在临床和环境样本中占主导地位[10]。小鼠动物模型实验显示，VG Ⅱ a型表现出更强的致病力[11]。廖万清等于1980年在国内首次发现格特隐球菌(S8012)属VG Ⅰ 型，菌株已被美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Center，ATCC)、比利时微生物协作保藏中心(Belgian Coordinated Collections of Microorganisms，BCCM)、荷兰微生物菌种保藏中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures，CBS)等真菌中心永久收录和保存，并向全球科研机构有偿供应(275美元/株)。2008年，姚志荣等在国内发现格特隐球菌VGⅡ基因型。本所陈敏等应用DNA指纹分析技术对从我国东南26个城市108例隐球菌脑膜炎患者体内分离的109株隐球菌进行分子流行病学研究。结果显示，从HIV阳性患者体内分离的20株隐球菌临床分离株中，18株(90%)为新生隐球菌格鲁比变种(15株基因型为VNⅠ型、3株为VNⅡ型)，另外2株(10%)则为新生隐球菌新生变种(基因型VNⅢ型)。从HIV阴性患者体内分离的89株隐球菌中，76株(85%)为新生隐球菌格鲁比变种(64株基因型为VNⅠ型、12株为VNⅡ型)、12株(14%)为格特隐球菌(11株基因型为VGⅠ型、1株为VGⅡ型)，只有1株(1%)是新生隐球菌新生变种(基因型为VNⅢ型)。在所有109株临床分离株中，106株为α交配型，2株为α/-交配型，1株为α/a交配型[12]。

2 真菌与宿主的相互作用

与一般微生物致病过程一样，病原真菌的致病也是病原真菌与感染个体相互作用、相互影响的过程。宿主通过多种防御机制抵御真菌侵袭，真菌通过多种毒力因子突破或利用宿主的这种防御功能从而致病。

宿主抵御真菌侵袭的保护机制有特异和非特异之分。非特异保护包括皮肤、黏膜对真菌的机械性阻碍、肠道正常菌群与病原真菌的竞争作用以及由中性粒细胞和巨噬细胞等介导的炎症反应。特异性免疫主要包括细胞免疫和体液免疫[13,14]。真菌被免疫系统识别并形成肉芽肿在抑制真菌感染播散的过程中发挥重要作用，该过程有多种细胞因子和免疫细胞参与[15]。而致病真菌在漫长的进化历程中产生多种毒力因子，适于在宿主体内生存。

在对新生隐球菌和格特隐球菌的研究中发现，隐球菌致病与其毒性因子有关。公认的致病隐球菌经典毒力因子包括菌体外荚膜、黑素、37 ℃中的良好生存、巨噬细胞内生长、胞外分泌磷脂酶B和尿素酶等[16]。墨汁染色在镜下可见隐球菌的厚壁荚膜，该特殊结构能帮助其抵制巨噬细胞的吞噬作用。如果被吞噬，大多数隐球菌可被巨噬细胞消灭；但当宿主免疫力降低时，隐球菌即使被吞噬，也能在细胞内生存，而能在巨噬细胞内生存是隐球菌向全身播散的重要原因。最近研究显示，含隐球菌的巨噬细胞通过血-脑屏障是隐球菌进入脑脊液造成隐球菌脑膜炎的主要途径，即“特洛伊木马”途径(Trojan horse strategy)[17]；隐球菌生产黑素可发挥抗吞噬细胞氧化杀菌作用、降低抗真菌药物敏感性、干扰抗体介导的吞噬作用和保护菌体在极端温度下生存。最新研究表明，隐球菌产生的尿素酶和磷脂酶与其在巨噬细胞内生存有直接联系[18]；而在37 ℃中生存则是该菌使人类致病的必要条件，与其他非致病真菌相比，隐球菌表现出更强的耐热性。这些毒力因子在隐球菌适应和逃避宿主免疫功能方面发挥重要作用。

通过基因敲除和比较基因组学分析确定了一些与上述隐球菌毒力因子有关的基因(如荚膜形成相关的GPA1、CAC1、STE12等，黑素生成相关的CAC1、PKA1等，37 ℃中生长相关的CNA1、CNB1、RAS1等，细胞内生存相关的PLB1、SOD1等)；并且发现新生隐球菌不同变种的关键毒力因子基因并不相同，如STE12是隐球菌新生变种的关键致病基因，而格鲁比变种的关键致病基因为STE20[19]。对隐球菌交配型的研究发现，α型新生隐球菌有更强的致病能力，这种致病能力受隐球菌MAT位点中的CPR基因控制[20]。但是这些毒力相关基因具体表达何种分子，又通过何种途径使隐球菌能逃避宿主免疫细胞的杀伤，有待深入研究。

另外，致病真菌的形态学变化也贯穿于真菌与宿主相互作用过程中。如白假丝酵母在感染宿主时产生芽生酵母(假菌丝)和菌丝，假菌丝状态可产生芽管特异抗原，增强该菌的黏附性。并且当宿主免疫力低下时，白假丝酵母被巨噬细胞吞噬后仍能在胞内产生菌丝，从而穿透、破坏巨噬细胞发挥更强的致病力。在感染过程中，形成菌丝的其他病原真菌还包括曲霉和接合菌的某些菌种。组织胞浆菌和皮炎芽生菌则表现出温度介导的双相性，在自然环境中以菌丝形态存在，而在宿主37 ℃环境中形成酵母样结构。有理由相信，这种形态学改变在真菌的致病过程中发挥至关重要的作用。与这些形态学变化有关的真菌信号通路有待进一步研究。

因此，随着研究深入，病原真菌与宿主相互作用过程已有所揭示，但仍存在较多的研究空白，有待继续发掘。明确病原真菌与宿主免疫系统相互作用过程，探讨其如何逃避宿主免疫细胞的杀伤及干扰宿主免疫功能对疾病诊治有重大意义，这正是推动侵袭性真菌临床预防和诊治研究的关键。

3 重要深部真菌病的诊断现况和进展

由于深部真菌病的症状、体征缺乏特异性，多有基础疾病掩盖，且不如细菌感染那样被临床医师熟知，所以经常造成漏诊、误诊。如侵袭性肺曲霉病经常被误诊为肺部细菌感染，肺隐球菌病被误诊为肺癌，隐球菌脑膜炎被误诊为病毒性脑膜炎、结核性脑膜炎。深部真菌病的诊断对临床医师和检验技师均是富有挑战的工作。目前，直接镜检、培养和组织病理学检查仍是深部真菌病诊断的“金标准”，但这些传统检验方法存在经验要求高、主观判断性强等缺点。影像学诊断作为辅助检查的重要手段可提示某些真菌病﹝如肺部高分辨计算机断层扫描(computed tomography，CT)出现“晕轮征”和“新月征”提示肺曲霉病﹞，但这种诊断方法缺乏敏感性和特异性。

基于真菌代谢产物分析的检测方法主要有API法和产色培养基鉴定法，前者通过观察真菌对鉴定板上不同培养基的同化情况，结合真菌菌落形态学特点鉴定菌种。产色培养基如科玛嘉假丝酵母显色培养基可对常见的致病假丝酵母进行鉴别，方便、直观，基本可满足临床假丝酵母鉴定的需要。但这种方法仅能对假丝酵母进行检测，鉴定能力有限，无法鉴别其他致病真菌。

随着对真菌研究的深入，真菌病的血清学诊断、基于真菌抗原检测的快速诊断以及鉴定真菌菌种的检验法已在临床得到广泛应用。

血清学诊断法主要包括抗原和抗体检测。隐球菌乳胶凝集试验以高效价抗隐球菌荚膜多糖抗体包被乳胶颗粒，检测血清或脑脊液标本中的隐球菌荚膜多糖抗原。曲霉半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)试验则是用双夹心酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测标本中的曲霉GM抗原，但患者感染马尔尼菲青霉时会出现假阳性结果，且对检测阈值的判断存在争议。隐球菌乳胶凝集试验和曲霉GM试验有较高的敏感度和特异度，且能半定量分析抗原，从而反映疾病进展情况。β-1,3-D-葡聚糖存在于除接合菌和隐球菌之外的真菌细胞壁中，其他微生物、哺乳动物体内不含此成分。20世纪90年代就有学者将其用于深部真菌感染的诊断，即G试验。但该法假阳性与假阴性报道屡见不鲜，甚至呼吸道定植的真菌亦可出现阳性结果[21]。

上述这些方法虽然能方便、快捷地鉴定真菌，但仍不能对真菌的亚型进行鉴别，且不能定量反映体内真菌含量。分子生物学技术的飞速发展，为深部真菌病的诊断带来了曙光。这种基于核酸分子杂交和核酸分子扩增的检测方法，对微生物的保守靶基因进行检测，从而保证检测的特异性。聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)相关分子生物学诊断方法现已用于临床乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的定量分析，有快速、灵敏、准确、所需样本量少等优点。分子生物学诊断方法在真菌病诊断方面有很大的发展空间，国外已用于临床培养标本和组织病理切片的双相真菌鉴定，商品化的荚膜组织胞浆菌、球孢子菌以及皮炎芽生菌DNA探针也已获美国食品药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准上市并广泛使用[22]。

活检组织、血液、肺泡灌洗液、脑脊液及培养分离的菌株均可作为分子生物学诊断的样本。PCR相关分子生物学诊断技术，如实时荧光定量PCR、套式PCR和多重PCR，是目前研究最多的检测方法。这些技术主要以真菌的rRNA基因及其中的内转录间隔区(internal transcribed space, ITS)为模板，设计引物进行检测。有学者应用套式实时荧光定量PCR对患者全血样本进行检测，发现对侵袭性曲霉病确诊和拟诊患者的检测敏感度达92.3%，特异度达94.6%[23]。该法还可用于真菌耐药基因检测，从而指导临床用药。曲霉对三唑类抗真菌药的耐药机制与编码胞膜上药物结合靶点羊毛固醇14α-脱甲基酶基因改变有关，有学者成功应用实时荧光定量PCR对耐药烟曲霉株的该突变基因进行了检测[24]。

其他分子生物学诊断方法还包括DNA指纹技术，其中限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)指纹分析法、微卫星长度多态性(microsatellite length polymorphism，MLP)和MLST可较可靠地对不同曲霉进行鉴定[25]，在真菌分子流行病学研究中有广阔用途。而DNA微阵列检测技术(microarry)因其所需样本少、高通量、自动化检测等优点，目前已用于真菌的毒力基因筛选。有学者将该法用于临床样本检测，也获得较好的敏感度[26]。核酸序列扩增法(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)是由1对特异引物识别、3种酶催化、以单链RNA为模板的恒温扩展技术，扩增效率高，目前已广泛用于多种DNA和RNA病毒的诊断，敏感度高，并已尝试用于真菌鉴定。

立足并不断改良传统诊断方法，结合血清学方法、影像学检查，是提高目前深部真菌病诊断水平的最佳途径；在此基础上开发的新型分子生物学检测方法由于价格昂贵、操作繁琐、缺乏标准，使用受到限制，现仅用于罕见、少见真菌感染的诊断，为临床提供了一种新的诊断方法。

4 抗真菌药物与真菌耐药

抗真菌药物的研发远落后于抗细菌药物的研发，临床可供选择的药物很少。如两性霉素B是一种古老的抗真菌药，对肝、肾毒性大，很多患者不能耐受，但因其抗真菌谱广、抗真菌活性强，现仍为许多深部真菌病的一线用药。

为适应临床需要，抗深部真菌药逐渐向低毒、广谱、高效的方向发展，主要成就体现在新型抗真菌药物的研制和新型药物载体的开发。近年来一些安全性较高的新型抗真菌药物如三唑类、棘白球素类药物用于临床，但受抗真菌活性及价格等因素限制，仍无法取代两性霉素B在临床的地位。在这种情况下，两性霉素B改良剂型——两性霉素B脂质体应运而生，虽可降低不良反应，但存在治疗剂量不稳定、毒性不明确，且价格昂贵等缺点。

常见的抗真菌药物根据作用机制不同分为：①作用于真菌细胞膜，如干扰麦角固醇合成(三唑类、丙烯胺类和吗啉类)、损害胞膜脂质结构及其功能(多烯类)；②影响真菌细胞壁合成(棘白菌素类)；③干扰真菌核酸合成(5-氟胞嘧啶)；④其他(碘化钾和在研的某些针对蛋白质翻译过程的新药)。

三唑类药物是近年来发展最快的抗真菌药。与第1代三唑类药物氟康唑和伊曲康唑相比，第2代三唑类抗真菌药伏立康唑、泊沙康唑和雷夫康唑(ravuconzazole)的抗真菌谱更广。伏立康唑对耐氟康唑的光滑假丝酵母和克柔假丝酵母仍有抗真菌活性，美国感染病学会(Infectious Diseases Society of America，IDSA)已将伏立康唑作为侵袭性曲霉病的一线用药[27]。泊沙康唑对接合菌也有较好的抗真菌作用，是现有抗真菌药物中除两性霉素B外对接合菌效果较好的药物。该药目前已在欧美上市，我国尚在审批中。

降低药物毒副作用的一条途径就是使药物仅针对微生物的特有结构。如β-内酰胺类抗生素是临床最为熟知的抗生素，以有效性和安全性而著称。究其原因就是它具有独特的作用靶点——细菌细胞壁的黏肽合成酶，即青霉素结合蛋白。因为人类细胞不含有细胞壁，所以该药针对性强，对人体的毒性小。虽然真菌也属于真核细胞，但与哺乳动物的细胞不同，真菌有细胞壁，主要成分为β-葡聚糖、几丁质和甘露聚糖蛋白复合物，它对维持真菌生长和正常生理功能有重要作用。针对这些成分的药物由于其高选择性及较强的抗真菌活性，是近年来抗真菌药物研究的一大热点。2001年在美国上市的第1种棘白菌素药物——卡泊芬净的作用机制就是抑制真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶。IDSA 在2009年更新的假丝酵母病治疗指南中将该药作为假丝酵母血症和食管假丝酵母病的一线用药，并对非白假丝酵母感染患者推荐使用[28]。另外2种棘白菌素药物——米卡芬净和阿尼芬净也分别于2005年和2006年获FDA批准上市。这3种药物中，阿尼芬净的半减期最长，达24 h，而且代谢过程不同于其他棘白菌素类抗真菌药。它在体内以化学降解方式清除，降解产物经胆汁由粪便排泄，适用于肝、肾功能不全患者。但棘白菌素类抗真菌药仅对假丝酵母和曲霉感染有效，对隐球菌、毛孢子菌、接合菌、镰刀菌感染无效。由于生物利用度的问题，该类药物均为静脉剂型，尚无口服制剂。

与细菌一样，真菌也存在对抗真菌药耐药性的问题。真菌耐药分为天然耐药(intrinsic)和获得性耐药(acquired)。如克柔假丝酵母、光滑假丝酵母和多数丝状真菌对氟康唑天然耐药，土曲霉对两性霉素B天然耐药，接合菌对多数抗真菌药物天然耐药。获得性耐药可能是致病真菌在抗真菌药物存在时迫于环境压力“优胜劣汰”所致，此时抗真菌药作用的真菌靶点相关基因多发生暂时或永久突变。如白假丝酵母对唑类药物获得性耐药的3个主要机制是药物外排泵基因(CDR1、CDR2等)激活、药物结合位点(编码羊毛固醇14α-脱甲基酶基因ERG11)突变或过度表达和导致麦角固醇合成减少的相关基因(ERG3)突变[29]。

测定抗真菌药物对病原真菌的抑制活性可采用体外药敏试验，但往往不能真实反映体内真菌对药物的敏感程度。这是因为真菌感染宿主是一个复杂的动态过程，众多的免疫细胞和炎性因子参与其中。体外试验无法完全模拟真菌在体内的生存状态，而且药代动力学、感染部位(如脑脊液、心脏瓣膜、眼和前列腺等特殊部位感染)的不同及真菌生物膜的形成都可能影响抗真菌药物的疗效。因此，临床抗真菌治疗失败的原因很多，真菌耐药可能只是原因之一，还需要从患者免疫状态、感染部位、药物生物利用度和药物代谢速度等多方面考虑。

5 结语

随着新技术、新方法的出现，人们对深部真菌病的流行病学、毒力因子等认识不断深入，对深部真菌病的诊治技术也有很大提高，但仍存在许多亟待解决的问题，如我国缺乏深部真菌病多中心流行病学调查、自动化临床真菌检测分析设备、分子生物学真菌诊断技术临床应用及新型抗真菌药物(包含新剂型)和疫苗的研制。解决这些问题将对临床深部真菌病的诊治和预防、抗真菌药物自主专利的研发有重要意义，可产生极大的社会和经济效益。

[1] Nucci M, Marr KA. Emerging fungal diseases [J]. Clin Infect Dis, 2005,41 (4):521-526.

[2] Wisplinghoff H, Bischoff T, Tallent SM, Seifert H, Wenzel RP, Edmond MB. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24 179 cases from a prospective nationwide surveillance study [J]. Clin Infect Dis, 2004, 39(3): 309-317.

[3] Roilides E, Farmaki E, Evdoridou J, Dotis J, Hatziioannidis E, Tsivitanidou M, Bibashi E, Filioti I, Sofianou D, Gil-Lamaignere C, Mueller FM, Kremenopoulos G. Neonatal candidiasis: analysis of epidemiology, drug susceptibility, and molecular typing of causative isolates [J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2004, 23 (10):745-750.

[4] Baddley JW, Stroud TP, Salzman D, Pappas PG. Invasive mold infections in allogeneic bone marrow transplant recipients [J]. Clin Infect Dis, 2001, 32 (9):1319-1324.

[5] Patterson TF, Kirkpatrick WR, White M, Hiemenz JW, Wingard JR, Dupont B, Rinaldi MG, Stevens DA, Graybill JR. Invasive aspergillosis:disease spectrum, treatment practices, and outcomes. I3 Aspergillus Study Group [J]. Medicine (Baltimore), 2000，79 (4):250-260.

[6] Park BI, Wannemuehler KA, Marston BJ, Marston BJ, Govender N, Pappas PG, Chiller TM. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS [J]. AIDS, 2009, 23 (4):525-530.

[7] Kwon-Chung KJ, Boekhout T, Fell JW, Diaz M. Proposal to conserve the name Cryptococcus gattii against C. hondurianus and C. bacillisporus (Basidiomycota, Hymenomycetes, Tremellomycetidae) [J/OL]. Taxon, 2002, 51(4): 804-806. http://www.jstor.org/stable/1555045?seq=1.

[8] Nguyen MH, Husain S, Clancy CJ, Peacock JE, Hung CC, Kontoyiannis DP, Morris AJ, Heath CH, Wagener M, Yu VL. Outcomes of central nervous system cryptococcosis vary with host immune function: results from a multi-center, prospective study [J]. J Infect, 2010, 61(5):419-426.

[9] Galanis E, Macdougall L. Epidemiology of Cryptococcus gattii, British Columbia, Canada, 1999-2007 [J]. Emerg Infect Dis, 2010, 16(2): 251-257.

[10] Byrnes EJ, Bildfell RJ, Frank SA, Mitchell TG, Marr KA, Heitman J. Molecular evidence that the range of the Vancouver Island outbreak of Cryptococcus gattii infection has expanded into the Pacific Northwest in the United States [J]. J Infect Dis, 2009, 199 (7): 1081-1086.

[11] Cheng PY, Sham A, Kronstad JW. Cryptococcus gattii isolates from the British Columbia cryptococcosis outbreak induce less protective inflammation in a murine model of infection than Cryptococcus neoformans [J]. Infect Immun, 2009, 77 (10):4284-4294.

[12] Chen M, Li XR, Wu SX, Tang XP, Feng BW, Yao ZR, Pan WH, Liao WQ, Quan ZX. Molecular epidemiology of Cryptococcus neoformans species complex isolates from HIV-positive and HIV-negative patients in southeast China [J]. Front Med China, 2010, 4(1):117-126. DOI: 10.1007/s11684-010-0011-z.

[13] Hill JO. CD4+T cells cause multinucleated giant cells to form around Cryptococcus neoformans and confine the yeast within the primary site of infection in the respiratory tract [J]. J Exp Med, 1992, 175(6): 1685-1695.

[14] Casadevall A. Antibody immunity and invasive fungal infections [J]. Infect Immun, 1995, 63 (11):4211-4218.

[15] Levitz SM. Overview of host defenses in fungal infections [J]. Clin Infect Dis, 1992, 14 (Suppl 1): S37-S42.

[16] Perfect JR. Cryptococcus neoformans: a sugar-coated killer with designer genes [J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2005, 45(3): 395-404.

[17] Charlier C, Nielsen K, Daou S, Brigitte M, Chretien F, Dromer F. Evidence of a role for monocytes in dissemination and brain invasion by Cryptococcus neoformans [J]. Infect Immun, 2009, 77 (1): 120-127.

[18] Shi M, Li SS, Zheng C, Jones GJ, Kim KS, Zhou H, Kubes P, Mody CH. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain [J]. J Clin Invest, 2010, 120 (5): 1683-1693.

[19] Wang P, Nichols CS, Lengeler KB, Cardenas ME, Cox GM, Perfect JR, Heitman J. Mating-type-specific and nonspecific PAK kinases play shared and divergent role in cytokinesis, differentiation and virulence of Cryptococcus neoformans [J]. Eukaryot Cell, 2002, 1 (2): 257-272.

[20] Chang YC, Miller GF, Kwon-Chung KJ. Importance of a developmentally regulated pheromone receptor of Cryptococcus neoformans for virulence [J]. Infect Immun, 2003, 71(9): 4953-4560.

[21] Koo S, Bryar JM, Page JH, Baden LR, Marty FM. Diagnostic performance of the (1,3)-beta-D-glucan assay for invasive fungal disease [J]. Clin Infect Dis, 2009, 49 (11):1650-1659.

[22] 钱琴芳, Kirby JE. 真菌感染的实验室诊断研究进展[J]. 微生物与感染, 2010, 5(1): 2-25.

[23] White PL, Linton CJ, Perry MD, Johnson EM, Barnes RA. The evolution and evaluation of a whole blood polymerase chain reaction assay for the detection of invasive aspergillosis in hematology patients in a routine clinical setting [J]. Clin Infect Dis, 2006, 42 (4): 479-486

[24] Garcia-Effron G, Dilger A, Alcazar-Fuoli L, Park S, Mellado E, Perlin DS. Rapid detection of triazole antifungal resistance in Aspergillus fumigatus [J]. J Clin Microbiol, 2008, 46 (4):1200-1206.

[25] Valk HA, Klaassen C, Meis J. Molecular typing of Aspergillus species [J]. Mycoses, 2008, 51 (6): 463-476.

[26] Spiess B, Seifarth W, Hummel M, Frank O, Fabarius A, Zheng C, Morz H, Hehlmann R, Buchheidt D. DNA microarray-based detection and identification of fungal pathogens in clinical samples from neutropenic patients [J]. J Clin Microbiol, 2007,45 (11):3743-3753.

[27] Walsh TJ, Anaissie EJ, Denning DW, Herbrecht R, Kontoyiannis DP, Marr KA, Morrison VA, Segal BH, Steinbach WJ, Stevens DA, van Burik JA, Wingard JR, Patterson TF. Treatment of aspergillosis: Clinical Practice Guidelines of the Infectious Diseases Society of America (IDSA). Clin Infect Dis, 2008, 46 (3):327-360.

[28] Pappas PG, Kauffman CA, Andes D, Benjamin DK Jr, Calandra TF, Edwards JE Jr, Filler SG, Fisher JF, Kullberg BJ, Ostrosky-Zeichner L, Reboli AC, Rex JH, Walsh TJ, Sobel JD. Clinical Practice Guidelines for the Management of Candidiasis: 2009 Update by the Infectious Diseases Society of America [J]. Clin Infect Dis, 2009, 48 (1): 503-535.

[29] Kontoyiannis DP, Lewis RE. Antifungal drug resistance of pathogenic fungi [J]. Lancet, 2002, 359 (9312):1135-1144.