自然杀伤T细胞抗胞内菌感染的研究进展

孔晓明，刘勇

蚌埠医学院微生物学教研室，安徽省感染与免疫重点实验室，蚌埠 233030

自然杀伤T细胞(natural killer T cell，NKT细胞)是一类介导天然免疫和获得性免疫的免疫细胞，它们既表达T细胞受体(T cell receptor，TCR)，又表达NK细胞表面标记CD161(NK1.1)。NKT细胞能特异性识别非经典的主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类样分子CD1d呈递的脂类抗原和蛋白质抗原，活化后的NKT细胞能同时分泌T辅助细胞1(T helper cell type 1，Th1)和Th2两类细胞因子，包括白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)、IL-4、γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等，同时激活下游多种其他免疫细胞，如树突细胞(dendritic cell，DC)、NK细胞、巨噬细胞、T细胞等，进而调节机体多种免疫效应[1]。大量研究表明，NKT细胞在抗胞内菌的感染免疫中发挥着重要作用。

1 NKT细胞的生物学特征

1.1 NKT细胞的分型

NKT细胞可分为Ⅰ～Ⅲ型：Ⅰ型NKT细胞大部分属CD4+和CD4-CD8-一类，主要特征为CD1d限制性，TCR多样性有限，只表达1条恒定的Vα14-Jα18链(小鼠)或Vα24-Jα18链(人)和1条Vβ链﹝包括Vβ8.2、Vβ7、Vβ2(小鼠)和Vβ11(人)﹞；Ⅱ型NKT细胞也表现为CD1d限制性，但表达多种TCR Vα链；Ⅲ型NKT细胞是CD1d非依赖性的，表达多种TCR Vα链，也称NKT样细胞[1]。

1.2 NKT细胞的检测方法

目前对NKT细胞表型的确定仍存有争议。常借助NK细胞谱系标记(小鼠为NK1.1，人为CD161)及TCRα/β共表达来界定NKT细胞。常用CD161(人)与TCRα/β共表达、NK1.1(仅C57BL/6小鼠表达)与TCRα/β共表达、DX5(NK1.1-小鼠)与TCRα/β共表达来标记。CD1d四聚体的出现对 Ⅰ 型和 Ⅱ 型NKT细胞的研究起了极好的推动作用。α-半乳糖神经酰胺 (α-galactosylceramide，α-GalCer)分子是目前与NKT细胞结合效能最强的糖脂抗原，能最大限度刺激NKT细胞产生Th1及Th2细胞因子[2]。应用此糖脂及CD1d建立的CD1d四聚体技术已成为目前检测NKT细胞的“金标准”[3]。但Ⅲ型NKT细胞即NKT样细胞，是CD1d非依赖性的，目前多采用DX5与TCRα/β共表达来界定。

1.3 NKT细胞的活化机制

不同于传统的T细胞，NKT细胞的活化可能有2条途径[4]：①直接识别微生物的脂类抗原，类似于传统的MHC限制性T细胞的活化模式，即NKT细胞的TCR识别抗原呈递细胞表面CD1d呈递的微生物脂类抗原，如大肠埃希菌的磷酯酰乙醇胺、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的脂阿拉伯甘露糖等，经信号转导通路直接被活化。②微生物抗原间接刺激模式，即微生物抗原诱导宿主产生某些因子(如IL-12、IL-18等)，这些因子能与NKT细胞表面的细胞因子受体结合，活化NKT细胞。有时该途径也同时需要CD1d呈递糖脂类抗原对TCR进行激活。陈钰等[5]研究发现，超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)也能活化NKT细胞，活化的NKT细胞亚群主要是CD8+NK1.1+和TCRVβ8+NK1.1+。

2 NKT细胞抗胞内菌感染的免疫应答作用

胞内菌分为兼性胞内菌和专性胞内菌2类。兼性胞内菌进入机体后主要在胞内寄居、繁殖；在体外，又能在无生命的培养基中生长。此类细菌有结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)、布鲁杆菌(Brucellasp.)、肺炎军团菌(Legionellapneumonia)、产单核细胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)等，多引起慢性感染。专性胞内菌包括立克次体、柯克斯体、衣原体等，只能在活细胞内生长、繁殖。机体抵抗胞内菌感染以细胞免疫为主。大量动物实验研究表明，NKT细胞在多种胞内菌感染中发挥抗感染作用[6]。

2.1 胞内菌与NKT细胞的活化

大量研究表明，胞内菌能活化NKT细胞。如伤寒沙门菌细胞壁上的脂多糖[7]与DC共培养，能诱导NKT细胞分泌IFN-γ。该过程需DC表达的Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR-4)、IL-4和CD1d参与，表明DC产生的IL-12能与NKT细胞表面的细胞因子受体结合，增强NKT细胞活化。大肠埃希菌脂多糖[8]活化NKT细胞只需IL-12和IL-18存在，而不需CD1d的呈递。LM通过改变DC和巨噬细胞表面CD1d的表达来活化NKT细胞，该过程需由IFN-β介导[9]。

研究发现，NKT细胞可识别分枝杆菌并产生相应的免疫应答效应。因为分枝杆菌细胞壁的脂类和磷酯酰胆碱甘露糖苷能激活NKT细胞，分泌IFN-γ的CD4-CD8-NKT细胞还可通过释放抗微生物的肽段(溶菌素)直接发挥抗分枝杆菌的作用[10]。伤寒沙门菌细胞壁上的脂多糖也能活化NKT细胞。

2.2 NKT细胞活化后发挥的抗感染能力

活化后的NKT细胞具有免疫调节功能，通过产生大量的IL-4、IFN-γ、IL-10、IL-13等细胞因子，或通过细胞间直接接触的方式，作用于NK细胞、B细胞、DC和T细胞，从而调节整个免疫网络。

Berntman等[11]研究发现，小鼠口服感染沙门菌5 d后，NKT细胞活化，参与早期免疫应答。其中分泌IFN-γ(发挥抗感染、抗肿瘤等机体保护功能)的CD4-CD8-NKT细胞增多，分泌IL-4(参与免疫调节，改善自身免疫性疾病的症状)的CD4+NKT细胞减少。Sada-Ovalle等[10]用感染结核分枝杆菌的巨噬细胞与清洁级C57BL/6小鼠的脾脏共培养，发现上清液中IFN-γ分泌增加，且培养液中细菌减少。实验表明，结核分枝杆菌感染的巨噬细胞能激活NKT细胞，活化后的NKT细胞能抑制结核分枝杆菌的复制，通过分泌IFN-γ识别并杀伤感染细胞。已证实，活化与未活化的NKT细胞均能保护宿主，抵抗结核分枝杆菌。Chiba等[12]发现，给予C57BL/6小鼠尾静脉注射卡介苗(bacillus Calmette-Guerin，BGG)感染后，肝脏和脾脏的NKT细胞可活化(CD69表达上调，但NK1.1+NKT细胞减少)，分泌IFN-γ。该实验采用BrdU方法(淋巴细胞增生试验)发现，在BCG感染早期(感染9 d内)，NKT细胞被激活并增殖；感染9 d后自适应性应答出现，NKT细胞开始衰落，通过Fas-FasL信号转导途径发生凋亡。Venkataswamy等[13]将NKT细胞活化剂α-GalCer注入到活的BCG中，发现α-GalCer-BCG能刺激DC成熟，并显著增强特有的CD8+T细胞反应，从而提高疫苗抗结核分枝杆菌的免疫保护效应。

Emoto等[14]给予C57BL/6小鼠α-GalCer或对照液处理1 d后，再通过腹腔注射LM感染1 h，检测腹腔、肝脏和脾脏中菌落形成单位(colony-forming unit，CFU)发现，α-GalCer能通过激活器官(不是腹腔)中的NKT细胞产生IFN-γ，从而加强巨噬细胞的杀菌和噬菌作用，减轻LM感染。Emoto等[15]发现，给予感染LM的小鼠α-GalCer后，大量骨髓来源的Gr-1+(粒细胞谱系标记)细胞及少量的γδ T细胞会迅速渗入肝脏，从而发挥强大的抗LM感染作用。

2.3 NKT细胞活化后表型特征的改变

大量研究发现，NKT细胞活化后，表面NK1.1分子表达下调，TCRα/β表达也下调，下调的原因尚未明确。

Emoto等[16]研究发现，在LM感染早期阶段，NK1.1+NKT细胞显著下降，NK1.1-NKT细胞显著上升，以分泌IFN-γ为主。研究认为,NK1.1+细胞是NK1.1-细胞的前体，NK1.1的丢失是为了清除抗原感染的细胞。

Emoto等[17]研究还发现，LM感染的肝脏NKT细胞表面NK1.1分子表达发生改变。在感染第4天，NK1.1分子表达下降；感染16 d后，NK1.1分子表达恢复到感染前水平。检测胞质TCRα/β(cTCRα/β)和细胞表面TCRα/β(sTCRα/β)发现，LM感染后NKT细胞的“丢失”很可能是因为TCRα/β的丢失或凋亡，但在LM感染的小鼠NK1.1+和NK1.1-NKT细胞群中检测不到活化的半胱天冬氨酸酶3(Caspase-3)[17]。

Werner等[18]比较了NK1.1-BALB/c小鼠肝脏和脾脏的DX5+NKT细胞在表型和功能上的差异发现，NKT细胞活化后，会发生典型的TCRα/β表达下调及CD178(启动死亡信号转导的Fas分子的配体)表达上调。

2.4 活化后的NKT细胞——连接天然免疫与获得性免疫的桥梁

活化后的NKT细胞几乎对所有血细胞，包括NK细胞、DC、B细胞及T细胞均有作用，因此活化的NKT细胞是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁[19]。

Joyee等[20]将衣原体感染Jα18-/-基因敲除小鼠与野生型小鼠后，比较CD8α+DC与NKT细胞共培养后的IFN-γ产量，发现活化后的NKT细胞会优先调节CD8α+DC的功能，从而引发天然免疫反应。Choi等研究发现，在LM静脉注射初次感染过程中，肝脏和脾脏的NKT细胞在感染第1天就被活化，表现为CD69表达上调；在感染第8天，通过分泌细胞因子(如IFN-γ、IL-12)，诱导适应性免疫反应，表现为传统性T细胞增加[21]。Fujii等[22]发现，NKT细胞被激活后，会激活下游的DC和NK细胞。DC会诱导NKT细胞持久分泌IFN-γ；而活化后的NKT细胞，其CD40表达上调，能通过CD40-CD40L的相互作用促使DC成熟，从而分泌IL-12，上调联合刺激分子，诱导适应性免疫捕获胞内抗原，以及延长联合CD4和CD8 T细胞免疫杀菌作用。

3 结语

含有糖脂类抗原的胞内菌，如大肠埃希菌和结核分枝杆菌，可直接活化NKT细胞；其他不含有糖脂类抗原的胞内菌，可通过诱导宿主产生某些因子(如IL-12)与NKT细胞表面的细胞因子受体结合，增强NKT细胞的活化。活化后的NKT细胞经分泌多种细胞因子发挥天然免疫反应，并激活下游多种其他免疫细胞，如DC、NK细胞、巨噬细胞、T细胞等，进而调节机体多种免疫效应。对活化后的NKT细胞表面TCRα/β和NK1.1的“丢失”机制尚需进一步研究。

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