消岩汤药物血清对A549/DDP细胞凋亡的诱导作用*

张 莹,贾英杰,杨 洁,李小江

(1.天津中医药大学第一附属医院肿瘤科,天津 300193;2.天津中医药大学 2007级硕士研究生,天津300193)

肿瘤细胞的多药耐药性(multid rugresistance, MDR)是肺癌化疗的重要障碍。化疗可以通过多种途径介导细胞凋亡来杀伤肿瘤细胞,因此肿瘤细胞对凋亡的耐受是多药耐药的一个重要机制[1]。前期研究证实,消岩汤含药血清对A 549及A549/DDP均有生长抑制作用,且能增强顺铂(DDP)对耐药细胞(A 549/DDP)的杀伤作用,具有耐药逆转作用[2]。本研究以人肺腺癌A549和A549/DDP细胞株为受试对象,研究了消岩汤荷瘤动物药物血清对细胞凋亡的影响,旨在进一步阐明消岩汤的抗耐药机制,为其应用于肿瘤的临床治疗提供更多的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

健康昆明种小鼠(KM)60只,SPF级,雄性,4～6周龄,体质量(20.99±1.87)g,购自天津市山川红实验动物科技有限公司,饲养设施 1级,动物质量许可证号:SCXK(津)2009-0001。

1.2 药 物

消岩汤组成:黄芪10 g,西洋参10 g,姜黄10 g,郁金10g,蕲蛇10 g,夏枯草10 g,生牡蛎10 g,白花蛇舌草10 g。规格100mL/瓶,由本院制剂室生产,生产时间 2009年 1月,批号 20090102。水煎浓缩剂制备方法参照《中药药物实验方法学》[3],将消岩汤于旋转蒸发器上浓缩成每毫升相当于原生药材 1.5 g的药液,冷却装入灭菌药瓶,置4℃冰箱备用[3]。

1.3 瘤 株

S180(腹水瘤)瘤株,由天津药物研究所提供。

1.4 试剂与仪器

RPMI1640培养基,Gibco公司产品;新生胎牛血清,杭州四季青生物工程公司产品;超净工作台,苏州净化设备公司产品;BB5060UVCO2细胞培养箱,德国Heraeus公司产品;流式细胞仪,美国BECKMAN-COULTER公司产品。

1.5 细胞系

人肺腺癌细胞系 A549,由天津市药物研究所提供;耐顺铂(DDP)肺腺癌细胞系A549/DDP,购自中国科学院肿瘤研究所。

1.6 荷 S180肿瘤小鼠模型的建立

小白鼠适应性饲养3 d后,称重,根据随机数目表数列随机分为消岩汤高剂量组、消岩汤低剂量组、模型对照组 3组,每组 20只。体外复苏,培养 S180细胞,在细胞的对数生长期收集细胞。1 500 r/min离心5 min,D-Hank's溶液洗涤2次,离心弃上清液,离心管外周以冰袋来维持温度在4℃左右,以此来保持瘤细胞的活性。用生理盐水稀释,调整细胞浓度到 1×106/mL。每只小鼠右前腋下皮下接种0.2m L[4],即得。

1.7 给药方法与剂量

小鼠于接种 S180肿瘤细胞 24 h后,高剂量组按消岩汤 40 g/kg灌胃给药;低剂量组按消岩汤20 g/kg灌胃给药;模型对照组以0.4m L生理盐水灌胃。每次灌胃间隔24 h,连续10 d。

1.8 取血与药物血清制备

末次灌胃1 h后,称量小鼠体质量,以眼眶取血法采血,无菌分离血清,56℃下30min灭活处理,然后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌,置-20℃保存备用。

1.9 流式细胞仪Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡

取对数生长期细胞A549和A549/DDP细胞,更换培养液,分别加入消岩汤高剂量组、消岩汤低剂量组、模型空白动物组血清继续培养 24 h。0.25%胰酶消化,A 549及A549/DDP悬浮细胞直接收集到10 mL的离心管中,每个样本细胞数为 1×106/m L, 1 000 r/min离心5 m in,弃去培养液。用4℃预冷的PBS洗涤细胞2次,1 000 r/min离心5min,弃上清液。用三蒸水按 1∶4稀释结合缓冲液。用 4℃预冷的PBS洗涤细胞2次,用250μL结合缓冲液重新悬浮细胞,调节其浓度为 1×105/m L。用 100μL细胞悬液于5mL流式管中,加入5 m L Annexin V/ FITC和5mL PI溶液。混匀后室温避光孵育15 min。流式细胞仪激发光波长为 488 nm,发射波长为530 nm,Annexin V/FITC的绿色波长通过FITC通道(FL1)检测;PI红色荧光通过PI通道(FL3)检测。

1.10 结果评价方法

左上象限PI阳性而Annexin V阴性提示为细胞碎片,右上象限PI和Annexin V均阳性为坏死细胞,左下象限PI和Annexin V均阴性为活细胞,右下象限PI阴性而Annexin V阳性为凋亡细胞。

1.11 统计学方法

采用SPSS 11.0统计分析软件处理。计量资料数据以均数(BZ_139_2138_999_2156_1045)±标准差(s)表示,以一步方差ANOVA分析组间差别,并经LSD检验,以P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

在消岩汤药物血清作用 A549细胞 24 h后,消岩汤低剂量组、消岩汤高剂量组细胞凋亡率分别与模型对照组比较,差别均有统计学意义(P＜0.05)。在药物血清作用于A549/DDP 24 h后消岩汤低剂量组与模型对照组对比,细胞凋亡率差别无统计学意义(P＞0.05);而消岩汤高剂量组与模型对照组对比,凋亡率差别则有统计学意义(P＜0.05)。表明消岩汤荷瘤动物药物血清对A 549和A549/DDP均有一定的促凋亡作用;消岩汤对顺铂诱导的A549/DDP耐药细胞的凋亡具有显著的增强作用;在一定范围内,细胞凋亡率与消岩汤浓度呈正相关。见表1。

表1 AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡率 %,±s

表1 AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡率 %,±s

注:与模型对照组对比,*P＞0.05,**P＜0.05。

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3 讨 论

肿瘤细胞对现有抗癌药物的耐受是目前肺癌化疗失败的主要原因。寻找既能有效克服肿瘤细胞耐药、毒副作用又小的抗癌药物,是目前临床上急需解决的问题。研究表明,所有肿瘤细胞都存在凋亡抑制现象[5],细胞凋亡受抑与 MDR发生密切相关。肺癌细胞在化疗药物诱导条件下的耐药表型改变都是为了抵抗药物杀灭,保护自身生存,凋亡途径异常与耐药发生紧密联系,多药耐药肺癌细胞的实质是抗凋亡[6],因此采取适当的方法促进或诱发耐药细胞凋亡是克服肺癌MDR的又一重要策略。

消岩汤是在“解毒祛瘀,扶正抗癌”中医学治疗肿瘤治则基础上,依据现代药理研究研制出的院内制剂,具有多种抗肿瘤活性,是治疗非小细胞肺癌的良好辅助用药[7-8]。方中黄芪、西洋参滋阴益气,扶正以驱邪;姜黄、郁金行气解郁,活血祛瘀;伍以蕲蛇更搜剔络脉中之瘀毒;夏枯草、生牡蛎、白花蛇舌草相伍以清热解毒,软坚散结。全方祛邪而不伤正,全面调节机体的阴阳平衡。现代药理学证明:方中单药有不同程度的抗癌、逆转多药耐药作用。姜黄素对人肺腺癌A549/DDP细胞增殖具有抑制作用,其作用机制可能是通过阻滞细胞周期进程和诱导细胞凋亡来实现的[9]。人参皂苷单体 Rb1具有钙离子通道拮抗作用从而逆转肿瘤MDR[10]。

流式细胞仪检测凋亡的方法有多种,其中以磷脂结合蛋白Annexin V-FITC/PI双标记染色最为常用。经前期研究证实,消岩汤具有耐药逆转作用[2]。本研究结果提示,消岩汤能够诱导发生MDR的A 549/DDP细胞发生凋亡,尽管机制不清,这仍为消岩汤对耐药肺癌患者提供了有效的实验依据,可为临床提供有效的MDR逆转措施,使肺癌患者得到更有效的治疗。

[1]陈卫强,戚好文,吴昌归,等.双氢青蒿素和顺铂诱导人肺腺癌A549/CDDP细胞凋亡[J].现代肿瘤医学,2007, 15(5):616-619.

[2]张莹,贾英杰,杨洁,等.消岩汤药物血清对A 549/DDP多药耐药逆转作用的研究[J].天津中医药,2010,27(4): 334-336.

[3]李仪奎.中药药物实验方法学[M].上海:上海科学技术出版社,1991:36.

[4]徐淑云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2005:1757-1766.

[5]Kerr JF,Winterford CM,Harmon BV.Apop tosis.Its significance in cancer and cancer therapy[J].Cancer,1994,73 (8):2013-2026.

[6]Costantini P,Jaeotot E,Deeaudin D.Mitochondrion as a novel targetofanticancer chemotherapy[J].JNatl Cancer Institute,2000,92(13):1042-1053.

[7]贾英杰,史福敏,贾彦焘,等.消岩汤剂治疗晚期非小细胞肺癌临床研究[J].天津中医药,2004,21(2):108-110.

[8]贾英杰,张莹,孙一予,等.消岩汤不同时段参与化疗治疗非小细胞肺癌临床疗效观察[J].天津中医药大学学报,2006,25(3):164-165.

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[10]史曦凯,张翼军,赵春景.人参皂苷单体 Rb1对多药耐药细胞系K562/HHT的耐药逆转作用[J].第三军医大学学报,1999,21(11):825-826.